ナノスケールの銅と銀の薄膜システムは、抗ウイルス性と抗菌性の違いを示す

Scientific Reports volume 12、記事番号: 7193 (2022) この記事を引用

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現在のコロナウイルス感染症 19 (COVID-19) のパンデミックは、感染リスクを軽減するために迅速に実施できるシンプルで効率的な予防戦略の必要性を例示しています。 さまざまな表面には抗菌特性の長い歴史があり、細菌感染の予防についてよく説明されています。 しかし、多くのウイルスに対するそれらの影響は詳しく研究されていません。 新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の文脈では、銅 (Cu) や銀 (Ag) コーティングを含むいくつかの表面が、ウイルスの伝播を遅らせるために簡単に導入できる効果的な抗ウイルス対策として説明されています。 この研究では、マグネトロンスパッタリングによってCu薄膜またはCu/Ag極薄バイメタルナノパッチとしてCuをコーティングした表面で、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2（SARS-CoV-2）に対する抗ウイルス特性を検出しました。 しかし、よく知られている抗菌特性とは対照的に、ウイルス力価に対する銀の影響は観察されませんでした。 電気化学的犠牲陽極メカニズムに基づいて銀イオン放出速度をさらに強化しても、抗ウイルス活性は増加しませんでした。 これらの結果は、Cu 薄膜システムと Ag 薄膜システムが、実装時に考慮する必要がある抗ウイルス特性と抗菌特性に大きな違いを示すことを明確に示しています。

Cu と Ag は何世紀にもわたって抗菌剤として知られていますが、抗生物質耐性微生物の出現が増加しているため、医療分野ではこれらの金属がここ数年で復活を遂げています。 これらの金属は、数多くの消費者製品に応用されるほかに、インプラントやデバイスへの細菌の定着を防止したり、院内感染を減らすための病院の衛生手順をサポートしたりするために、さまざまな生体材料や医療現場でも使用されています。 特に、コロナウイルス感染症 19 (COVID-19) を引き起こす重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2 (SARS-CoV-2) のパンデミックの蔓延は、ウイルス感染の制御に貢献する効果的な公衆衛生介入戦略の必要性を例示しています。 しかし、付着したウイルス粒子を不活性化し、それによって汚染された表面からのウイルスの伝播を妨げることができる抗ウイルス表面の開発は、ウイルスと比較して微生物の固有の特性が異なるため、困難を極めています。

Cu と Ag はどちらも広範な抗菌活性 (細菌、真菌、ウイルス) を発揮し、両方とも微生物の広範囲の標的を攻撃するため、微生物耐性を誘発する発生率は低くなります 1,2,3。Ag の抗菌活性は次の要因と強く関連しています。酸化的溶解によって形成される Ag イオン (Ag+) の放出ですが、対照的に、ゼロ価の Ag (Ag0) は同等の抗菌活性を発揮しません 2,4,5,6。 Ag+ イオンは、細胞膜および細胞壁成分、チオールリガンド、例えば代謝酵素のスルフヒドリル基、核酸などの細胞内のさまざまな生体分子と相互作用します。 さらに、Ag+ イオンにより活性酸素種 (ROS) が生成され、有害な酸化ストレス効果を引き起こします 2,7,8。 一般に、その結​​果は生体分子の損傷とその後の細胞機能不全であり、最終的には細菌の増殖が阻害され、最終的には殺菌効果が得られます。 Ag の抗菌効率は、Ag ナノ粒子などを使用して Ag+ 放出表面積を増加させることで高めることができます9。 さらに、最近、電気化学的な犠牲アノード機構に基づいて Ag+ 放出速度を強化するコンセプトを発表しました 10、11、12。 電解環境（体液など）内で Ag とより貴な金属（Au、Pt、Pd、または Ir）を組み合わせると、より貴な部分が優先して、より貴でない Ag が腐食します（「犠牲」になります）。 我々は、このような犠牲アノード表面は、電気化学的に促進されるAgの溶解促進により、総Ag+がはるかに高い純粋なAg表面と比較して、はるかに高い抗菌効果を発揮することを実証しました。 銀の抗菌活性は十分に理解されているにもかかわらず、銀の抗ウイルス効果を記載した研究はほとんどなく、そのほとんどは銀ナノ粒子を扱っています13。 最近、スパッタリングされた Ag ナノクラスター/シリカ複合体のフェイスマスクに対する殺ウイルス効果が報告されました 14。

Ag 表面材料とは対照的に、Cu および Cu 合金表面の殺ウイルス特性はより頻繁に研究されています 13。 Cu の殺ウイルス効果はイオンの放出にも依存しており、両方の Cu イオン種 (Cu II および Cu I) が殺生物活性に寄与します 15、16、17。

注目すべきことに、試験条件の変動を避けるために等しいコーティングパラメータと等しい金属イオン濃度を使用した同じ実験設定内で、CuとAgの殺菌特性と殺ウイルス特性に反対する比較研究が存在しません。 私たちの研究結果は、特に殺ウイルス活性に重点を置いた、Cu および Ag を含む表面材料の設計に関連しています。 したがって、我々は、Cu または Ag でコーティングされた表面、および相乗効果の可能性を検討する Cu と Ag の組み合わせを含むいくつかの Ag ベースの犠牲アノード表面の抗ウイルス特性を分析し、抗ウイルス性能と抗菌性能を比較することを目的としました。

この結果は、さまざまなスパッタリングされた薄膜表面 (詳細については実験方法を参照) を使用して達成されました: (I) Ag と Cu の連続した緻密な薄膜 (厚さ 50 nm)、および (II) 表面積の大きいナノ構造表面。 ナノ構造表面は、(a) Pt 上に Ag、Ag 上に Cu を順次堆積することによって、または (b) Ag と Pt、および Cu と Ag を同時スパッタリングすることによって合成されました。 我々は、結果として得られる表面構造を「ナノパッチ」、すなわち2つの金属によって形成されるナノアイランドと呼びます。 概略的なワークフローを図 1 に示します。逐次スパッタリング (Pt 上に Ag、Ag 上に Cu) の場合、元素が原子スケールで混合する傾向がある同時スパッタリング (Ag と Pt) に比べて、元素がより分離される傾向があります。 、Cu & Ag）、元素膜（Pt 上の Ag、Ag 上の Cu）の共存と比較して、むしろ合金（強制固溶体）を形成します。 後者は、より優れた犠牲陽極特性を有することが期待される。 我々は、金属イオンを放出するために異なる体積の材料（例えば、薄いAg/Ptと厚いAg/Pt）を提供する2つの異なる厚さのナノパッチを合成しました（表1）。 ナノスケール膜の走査型電子顕微鏡 (SEM) および透過型電子顕微鏡 (TEM) 画像の例を図 2 に示します。厚さ 50 nm の膜は連続的であり、異なるナノ結晶表面微細構造を示しています。Ag 膜はより粗く、より大きな粒子を示しています。 （図２Ａ）をＣｕ膜（図２Ｂ）と比較した。 ナノパッチ（Ag、Ag & Pt、Ag & Cu）の SEM および TEM 画像（図 2C ～ F）は、これらのナノ構造が不連続であることを示しています。 これらは固定化されたナノ粒子とみなすことができるため、連続フィルムよりも大きな表面積を提供します。 Ag-Pt ナノパッチのナノ構造の詳細な TEM 研究は参考文献 12 にあります。

スパッタ堆積による Cu および Ag 薄膜ナノ構造の製造の概略図 (縮尺は不正確)。 (A) 厚さ 50 nm の緻密で連続した膜として均一にスパッタリングされた元素 Cu。 (B) 120 秒間同時スパッタリングされた Cu および Ag ナノパッチ。 (C) Cu および Ag ナノパッチは 120 秒ごとに連続的にスパッタリングされました。 ナノパッチは、公称厚さが 5 nm 未満の島状のナノ構造です。

連続ナノスケールフィルム（A、B）とナノパッチ（C〜F）の電子顕微鏡画像の例。 (A) 50 nm Ag の SEM 上面図、(B) 50 nm Cu の SEM 上面図、(C) 60 秒間スパッタリングされた Ag ナノパッチの SEM 上面図、(D) 60 秒間同時スパッタリングされた Ag および Pt ナノパッチの SEM 上面図、 (E) TEM グリッド上で 60 秒間同時スパッタリングされた Ag および Cu ナノパッチの TEM 画像、(F) TEM グリッド上で 60 秒間連続スパッタリングされた Ag 上の Cu ナノパッチ。 (E、F) 参考文献 18 から引用。

スパッタリングされた Ag および Cu 表面の抗菌特性と抗ウイルス特性を定性的に比較するために、最初に薄い Ag/Pt および Ag/Cu 犠牲アノード ナノパッチの抗菌特性を評価しました。 細菌検査は、浮遊細菌および付着細菌の分析を可能にする液滴ベースの実験設定を使用して、黄色ブドウ球菌 (S. aureus) で実施されました。 液滴内の浮遊細菌は血液寒天プレート上にプレーティングすることによって定量化され、サンプル表面上の付着細菌は蛍光顕微鏡によって視覚化されました。

純粋なTi薄膜、ならびに純粋なPt、Ag、およびCuの薄いナノパッチは対照として機能し、黄色ブドウ球菌に対して顕著な抗菌活性を示さなかった(図3A)。 同様に、細菌の増殖は、共蒸着された薄い Ag/Pt ナノパッチの影響を受けず、犠牲陽極効果が存在しないことを示しています (図 3B)。 対照的に、連続堆積された薄いAg/Ptナノパッチと同時堆積および連続堆積された薄いAg/Cuナノパッチは、24時間のインキュベーション後の細菌の増殖を効果的に防止しました（図3B）。

(A) 連続 Ti 薄膜 (Ti コントロール) および Ti 薄膜上にスパッタリングされた Pt、Ag、および Cu の薄いナノパッチの黄色ブドウ球菌 (104 CFU/mL) に対する抗菌活性 (B) 薄い Ag/Pt と比較薄いAg/Cuナノパッチは、同時にスパッタリング（すなわち、共蒸着）または連続的に（最初のPt、2番目のAg、または最初のAg、2番目のCu）スパッタリングされます。 すべてのサンプルのスパッタ時間は 60 秒です。 上の図: 24 時間インキュベートし、SYTO-9 で染色した後のサンプル表面上の付着細菌の代表的な蛍光画像 (緑色蛍光)。 下の画像: さまざまなサンプル上で 24 時間インキュベートした後の液滴液中の浮遊性細菌をプレートした代表的な血液寒天プレート (白い細菌コロニーは生細胞を示します)。

Ag と Cu の抗菌活性は、イオンの放出と細胞成分および細胞プロセスとの相互作用に強く関係していることが一般に認められているため、酢酸銀 (AgAc) と硫酸銅 (CuSO4) の溶液をイオン制御として使用しました。グラム陽性菌黄色ブドウ球菌に対する銀と銅の抗菌活性13,14。 AgAc では 1.0 μg/mL 以上の濃度で顕著な抗菌効果が検出されましたが、CuSO4 では 5.0 μg/mL 以上の濃度で顕著な抗菌効果が引き起こされました (図 4)。

AlamarBlue アッセイによって行われた、黄色ブドウ球菌 (さまざまな細菌濃度) に対する酢酸銀 (AgAc、パネル A) および硫酸銅 (CuSO4、パネル B) 溶液の抗菌活性の定量分析。 データは、少なくとも 3 回の独立した実験の平均 ± SD として表され、未処理の細菌 (曝露なし) のパーセンテージとして示されます。 アスタリスク (*) は、未処理の対照と比較した有意差 (*p ≤ 0.05) を示します。 ハッシュマークは、AgAc と CuSO4 の間の有意な差 (*p ≤ 0.05) を示します。

これらの結果は、純粋な Ag および Cu ナノパッチの抗菌効果の欠如は、これらの構造からのイオン放出が不十分であるためである一方、Ag と Pt、および Ag と Cu の組み合わせは、電気化学的に駆動される溶解促進に基づいて抗菌活性の向上をもたらすことを示しています。それぞれAgとCuの合金です（図3）。 以前、我々はナノ粒子およびナノ構造の Ag/Pt システムに対するこのような犠牲アノード効果を実証しました 11、12、15。 Ag/Cu システムに関しては、Cu に対する Ag の犠牲アノード効果に加えて、2 つの抗菌金属の組み合わせ効果が考慮される可能性があります 10,12。

以前の結果に従って、スパッタリングされたAgおよびCu表面、およびイオン性AgおよびCu溶液の抗菌効果を実証した後、次のステップでは、SARS-CoV-2に対するこれらの表面の潜在的な抗ウイルス効果を分析することを目的としました。 ウイルス力価を TCID50/mL として決定する前に、表面上に SARS-CoV-2 を 1 時間または 24 時間接種してウイルス汚染を模倣しました (図 5)。 Si/SiO2 片上にスパッタリングされた Cu 薄膜では、1 時間および 24 時間のインキュベーション後に顕著な抗ウイルス効果が観察され、ウイルス力価がそれぞれ 3 log10 および 4.5 log10 減少しましたが、Ag フィルムはウイルス力価を減少させませんでした (図 5A)。 対照的に、スパッタリングされた銀表面は、24 時間曝露してもウイルス力価にわずかにのみ影響し、顕著な影響はありませんでした。 ICP-MS分析は、10,000〜14,200μmol/Lの範囲のCuイオンが24時間以内にこれらのフィルムから放出されることを示唆し、この量がSARS-CoV-2を効率的に不活化するのに十分であることを示しました（補足図1）。 Agナノパッチはウイルス感染力に影響を与えなかったが、Cuの厚い層を備えたナノパッチは、SARS-CoV-2と一緒に24時間インキュベートするとウイルス力価を1 log10減少させ（図5B）、その結果、約720μmol/μmolのイオン放出がもたらされた。 L（補足図1）。 興味深いことに、Cu & AgおよびCu on Agナノパッチは、同様の量のCuが放出されたにもかかわらず（870μmol / L、補足図1）、Cuのみの抗ウイルス特性を強化し、24時間後に顕著な抗ウイルス効果を示しました。 これは、犠牲アノード構造における電気化学的な Cu イオン放出メカニズムの改善に関連している可能性があります。Ag の存在により Cu イオンが還元プロセスをサポートするため、Cu は容易に酸化されて媒体に放出されます。 薄い層ではウイルス力価が 2.2 log10 減少しましたが、厚い層ではウイルスの不活化が増加し、減少係数は 3.9 log10 となりました (図 5C)。 同時に堆積されたナノパッチと順次堆積されたナノパッチとの間で検出された抗ウイルス効果に差はなかった。 これは、純粋なCuフィルムが最高の抗ウイルス効果を提供することを示しており（図5A）、これは最高のイオン放出（13,000μmol / L、補足図1）と相関しています。 対照的に、同時堆積および連続堆積された Ag-Pt ナノパッチは、1 時間のインキュベーション以内ではウイルス感染力を低下させませんでした。 軽度ではあるが有意ではない抗ウイルス効果（ウイルス力価の1 log10減少）が、薄いAgおよびPtおよびPtナノパッチ上の薄いAgとの24時間のインキュベーション後に観察された（図5D）。 銀でコーティングされた表面がウイルス感染力に影響を及ぼさないという観察をさらに調べるために、酢酸銀溶液（AgAc）を参照として使用し、薄膜から放出されるものと比較してより高いイオン濃度での銀の抗ウイルス特性をテストしました。表面またはナノパッチ構造。 1 μg/mL から最大 50 μg/mL Ag の範囲の濃度を含め、ウイルス感染力を TCID50/mL として決定する前に、SARS-CoV-2 を含む上清を溶液に 1 時間または 24 時間接種しました。 25 μg/mL 以上の濃度のみが抗ウイルス特性を示し、SARS-CoV-2 の感染力を完全に消失させましたが、これは 24 時間の長時間インキュベートした場合のみでした (図 5E)。 対照的に、同様の実験設定におけるCuSO4溶液へのウイルス曝露は、ウイルス力価に影響を与えなかった(図5F)。 結論として、我々は、1時間以内のSARS-CoV-2に対するCuコーティング表面の明らかな抗ウイルス効果を実証したが、Agコーティング表面はウイルス感染力に影響を与えなかった。

(A) Si/SiO2 片上にスパッタリングされた Cu および Ag 薄膜、または (B-D) Si/SiO2 上にスパッタリングされたナノパッチを、指定された期間 SARS-CoV-2 とともにインキュベートした場合の抗ウイルス活性の結果。 (E – F) イオン対照として使用される酢酸銀 (AgAc) および硫酸銅 (CuSO4) 溶液に SARS-CoV-2 をスパイクし、同様の時間インキュベートしました。 残留感染性ウイルスをTCID50計算により定量した。 点線は定量下限値を示します。 データは、3 回の独立した実験の平均値 ± SD として表されます。 アスタリスク (*) は、MOCK (未処理の対照) または Si/SiO2 と比較した有意差 (*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001) を示します。

微生物やウイルスの病気と闘うためには、迅速かつ効果的な予防策が緊急に必要とされています。 汚染された表面を介した媒介物の伝染は、いくつかのウイルスを含むさまざまな微生物で報告されており、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) との関連で議論されています。 SARS-CoV-2 の蔓延に対して表面が果たす役割は小さいと考えられていますが、公衆衛生介入戦略は依然としてウイルス感染を減らすために消毒手順に依存しています。 ナノ構造材料や、市販の抗菌/抗ウイルス箔、織物、塗料などの抗菌剤 (抗生物質、抗ウイルス薬、ナノ粒子など) を含む材料を含む、地形的および/または化学的に誘導された抗菌活性を示すさまざまな表面コーティングが提案されています。もっと見る19,20。 消毒は感染拡大の防止に効果的ですが、広く使用されている多くの表面消毒剤や手指消毒剤の生物学的活性物質は、特に長期間使用したり誤使用したりすると、人や環境に危険を及ぼす可能性もあります。 特に、皮膚や目の炎症、呼吸路への化学火傷が発生する可能性があります。 通常、有害な因子に対する保護バリアとなる正常な皮膚細菌叢が破壊されると、感染のリスクがさらに高まる可能性があります21。

van Doremalenらと同様に、SARS-CoV-2は、この研究の他のすべての薄膜と比較して、スパッタリングされたCu表面上では安定性が低かった18。 膜が厚くなると抗ウイルス効果がより顕著になります。 対照的に、Cu ナノ構造は抗ウイルス効果を減少させました。これは、放出される Cu イオンの量が減少したことに起因すると考えられます。 興味深いことに、同時スパッタリングまたはAg上にCuを連続蒸着することによってCuとAgを組み合わせると、特に限界希釈アッセイで監視した場合、24時間の長時間インキュベーション後にナノスケール構造（Ag-Cuナノパッチと比較したCuナノパッチ）の抗ウイルス効果が強化されました。 。 対照的に、純粋なAgまたはAgベースの犠牲陽極ナノパッチ（AgとPtの組み合わせ）の薄膜は、Agイオンの効率的な放出にもかかわらず、SARS-CoV-2を不活化する顕著な能力を示さなかった（図5B〜D）。 イオン制御実験により、24 時間インキュベートした場合にウイルス力価を大幅に低下させるには、最低濃度 25 μg/mL 以上が必要であることが実証されました。 酢酸銀濃度またはインキュベーション期間を減らすと、抗ウイルス効果は完全に消失しました（図 5E）。 これは、非常に高濃度の銀イオンのみが SARS-CoV-2 に影響を与えることを意味します。 過去には、抗ウイルス活性の研究に使用されるナノ粒子 (NP) のほとんどは Ag で作られていました (レビューについては 20,21 を参照)。たとえば、HIV-1 の感染力は 25 μg Ag/mL 以上の濃度で阻害されました 19,21。 最近、ジェレミアら。 Ag NP (10 nm) は、1 ～ 10 μg/mL の濃度で細胞外 SARS-CoV-2 を低濃度で阻害する効果がすでにあると報告しました 22。しかし、ナノ粒子は、立体構造などの結合後にウイルスに対して追加の粒子効果を及ぼす可能性があります。阻害。 また、Au-NP (1 μg/mL) と Ag-NP (5 μg/mL) を含む溶液中のナノ粒子の混合物は、SARS-CoV-2 およびインフルエンザ ウイルスに対して効果的でしたが、この混合物には大量のナノ粒子も含まれていました (60 µg/mL) の ZnO-NP と追加の ClO223。 一般に、ナノ粒子を用いた研究は、拡大した表面、高いイオン放出、細胞への取り込み、静電的相互作用、立体的相互作用などのいくつかの事実により、薄膜（または薄いバルク材料）に関する研究と直接比較できないことを考慮する必要があります。小さな粒子の影響やその他の要因。 薄膜表面、ナノパッチ、イオン溶液に関する我々の結果は、銀の抗ウイルス活性と抗菌活性の違いを明確に示しています。 SARS-CoV-2 を不活化するには、有効な抗菌濃度と比較して約 10 倍高い濃度の銀イオンが必要です。 その理由は、ウイルスと細菌の性質の違いに関連している可能性があります。 生物として、細菌は、ウイルス粒子と比較して、エネルギー生成や細胞増殖など、はるかに抗原感受性の高い代謝プロセスを提供します。 さらに、黄色ブドウ球菌などの一部の細菌は、高い Cu 濃度での増殖に対して顕著な固有の耐性を示します 24。 ただし、50 μg/mL までの硫酸銅溶液は SARS-CoV-2 を不活化しませんでした (図 5F)。 私たちの研究では、直接比較できるように、Ag および Cu のイオン溶液は最大 50 μg 金属/mL まで同様の濃度でした。 イオン性 Ag は 1 μg/mL 以上の濃度で抗菌性がありますが、イオン性 Cu は細菌の増殖を阻害するためにはるかに高い濃度が必要です (例: 10 mM CuSO4)。 いくつかのグループは、Ag イオンと Cu イオンの間で抗菌効率に同様の違いがあることを観察しました 24,25,26。ただし、水の試験媒体により総イオン濃度が低くなりました 26。 したがって、等モル濃度では、Ag イオンは Cu イオンと比較して優れた抗菌性能を示します。 可溶性 Cu イオンによるウイルス阻害には、実験で使用した最大値 (50 μg/mL) を超える高濃度が必要な場合があります。

イオン種とは対照的に、固体の Ag および Cu のスパッタリング表面の抗菌および抗ウイルス活性は、異なる結果をもたらします。 純粋な銀のナノパッチは抗菌活性も抗ウイルス活性も示しません。 明らかに、これらの実験条件下では Ag イオンの放出が不十分です。 この制限された Ag イオン放出を克服するには、ここで Ag/Pt サンプルでも観察されたように、総 Ag 含有量が低くてもはるかに優れた抗菌効率を示すため、より活性なイオン放出犠牲アノード表面を使用できます 11,12 (図 3)。 。 しかし、これらの抗菌性 Ag/Pt サンプルでさえ抗ウイルス効果を誘発することはできず、抗ウイルス活性を達成するにはより高い Ag イオン濃度が必要であることが改めて示されました。

注目すべきことに、我々の研究は、固体状態のCuは緻密な膜またはナノパッチとして抗ウイルス活性を誘導できるが、固体状態のAgは誘導できないことを示している。 抗ウイルス効果は、総 Cu 量 (スパッタリングされた Cu の厚さと放出されたイオン) およびサンプルの曝露時間に依存します。

固体状態の第一銅化合物は効率的な抗ウイルス活性を示すが、固体状態の銀の抗ウイルス活性は著しく低いことが報告されている27。 特に、インフルエンザウイルスの HA および NA 表面タンパク質の不活化は、Ag および Cu28 への曝露によって影響を受けます。 固体状態の Ag は、イオン種を放出する実験条件下で固体状態の Cu よりも表面酸化の影響を受けにくい29。 酸化亜銅 (Cu2O)、硫化物 (Cu2S)、塩化物 (CuCl) などの Cu のいくつかの代謝産物は高い抗ウイルス活性を示し、酸化物形成後も Cu 表面は抗感染症特性を保持することが知られています 27,30。

銀または銅とそれらの関連化合物の抗菌効果および抗ウイルス効果に関する報告は数多くありますが、細菌データとウイルスデータの両方を含む、私たちの研究で行われたような銀と銅の直接比較はほとんど見られず、報告された研究方法にはばらつきが大きくあります。そのような直接比較は困難です31。

最近、銅-銀 (Cu-Ag) ナノハイブリッド表面における SARS-CoV-2 の急速な阻害が報告され、著者らは、SARS-CoV-2 の一次阻害の役割は銅含有量によるものであると考えました 32。 我々の結果は、Cu と Ag の組み合わせ (Cu & Ag ナノパッチ) が、Cu または Ag 単独からなる同様のナノパッチよりも大幅に高い抗ウイルス活性を発揮することを示しました。 この効果は、Ag ナノパッチと比較して Ag イオン放出が大幅に減少すると同時に、Cu および Ag ナノパッチの Cu イオン放出が強化されることに起因すると考えられます。 それでも、ナノパッチによる抗ウイルス効果を可能にするためには、銀の存在が必要であるようです。 これらの発見は、犠牲陽極効果などの電気化学プロセスが重要な役割を果たしている可能性を示唆しています。 ただし、この正確なメカニズムは、さらなる研究でまだ解明される必要があります。

まとめると、殺菌性表面は、再発する汚染に対して一定の抗ウイルスおよび抗菌効果を提供し、その結果、表面が清潔な状態に保たれ、使い果たされないことを考慮すると、特定の病原体の蔓延を減らすことができますが、表面の消毒は汚染のたびに再適用する必要があります 33。 銅ベースの材料および表面の抗菌活性は、SARS-CoV-2、MRSA (メチシリン耐性黄色ブドウ球菌)、VRE (バンコマイシン耐性腸球菌)、その他の院内病原体を含むさまざまな病原体に対して実証されています。 - スプレーコーティングまたは Cu 含浸により、既存の表面を完全に交換する必要が回避されます 34、35、36。 ただし、1 時間を超える潜伏期間は多くの投与には適用できないため、標的となる病原体に関して予防策を厳しく評価する必要があります。

薄膜サンプルは、室温、Ar 雰囲気 (0.5 Pa) 中で、回転基板プレート上に配置された熱酸化 Si 基板 (Si/SiO2、4.4 mm × 4.4 mm) 上に直流マグネトロン スパッタリングによって作成されました。 直径 2 インチの Cu (純度 99.99%、EvoChem)、Ag (99.99%、EvoChem)、および Pt (99.99%、ESG Edelmetall Services) のスパッタ ターゲットを使用しました。 すべてのフィルムのデータを表 1 に示します。フィルムの公称厚さは、使用した元素の所定のスパッタ レートと示された電力レベルから計算されました。 走査型電子顕微鏡 (SEM) および透過型電子顕微鏡 (TEM) 画像の例を図 1 に示します。

細菌試験は、ドイツ微生物および細胞培養コレクション（ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から入手した黄色ブドウ球菌（黄色ブドウ球菌、DSMZ 1104）を用いて実施した。 黄色ブドウ球菌培養物を、振盪水浴（JULABO GmbH、ゼールバッハ、ドイツ）を使用して37℃のブレイン・ハート・インフュージョン・ブロス（BHIブロス、bioMerieux、リヨン、フランス）中で一晩増殖させ、細菌濃度を濁度測定によって決定した（Densichek）濁度光度計、ビオメリュー）。 以前に報告されたように、ドロップベースの実験設定を使用して、さまざまなナノパッチサンプル上の黄色ブドウ球菌の付着と増殖を分析しました10、11。 簡単に説明すると、mL あたり 104 個の細胞 (CFU/mL) を含む BHI ブロス中の細菌溶液 30 μL を各試験サンプルの中央に置き、続いて細胞培養条件下の湿潤チャンバー (水飽和雰囲気) 内で 24 時間インキュベートしました。 37 °C、5% CO2)。 続いて、液滴を吸引し、段階希釈(1:104)し、浮遊細菌の定量分析のためにコロンビア血液寒天プレート(bioMerieux)上にプレーティングした。 付着細菌の定性分析は、SYTO-9 染色 (Molecular Probes、Invitrogen、カールスルーエ、ドイツ) によって実行され、蛍光顕微鏡 (BX61 顕微鏡、Olympus、ハンブルク、ドイツ) によって検出されました。

酢酸銀 (AgC2H3O2、AgAc) 溶液と硫酸銅 (CuSO4) 溶液を、それぞれ Ag と Cu の抗菌活性のイオン対照として使用しました。 各溶液は滅菌超純水で調製され、総金属含有量に対して正規化されました (つまり、たとえば 100 μg/mL AgAc には 100 μg/mL Ag が含まれます)。 異なる細菌濃度 (103、104、105 CFU/mL) の黄色ブドウ球菌を、異なる濃度の AgAc および CuSO4 溶液 (0.5、1.0、2.5、5.0、10、25、50 μg/mL) とともに BHI 中で 24 時間インキュベートしました。細胞培養条件下で総サンプル量 200 µL で 96 ウェルマイクロプレートに培養します。 続いて、AlamarBlue アッセイにより生細胞の定量を実施しました。 したがって、細菌懸濁液を 20 µL の AlamarBlue 試薬 (Invitrogen) とともに目に見える色変化が現れるまでインキュベートし、蛍光強度をマイクロプレート リーダー (FLUOstar Optima、BMG LABTECH GmbH、Ortenberg、ドイツ) によって 590 nm で分析しました。 処理した培養物のデータ (平均 ± SD) は、未処理の対照 (AgAc または CuSO4 なしで培養した細菌) のパーセンテージとして示します。

Si/SiO2 片上にスパッタリングされた薄膜の不活化能力を評価するには (薄膜のスパッタ堆積を参照)、25 μL の SARS-CoV-2 (hCoV-19/ドイツ/BY-Bochum-1/2020; GISAID アクセッション ID: EPI_ISL_1118929; 8.8 × 106 TCID50/mL) を各試験サンプルの中央にスポットし、室温 (22 ± 1 °C) および湿度 32 ± 1% で 1 時間および 24 時間インキュベートしました。 10% (v/v) ウシ胎児血清 (FCS)、1% (v/v) 非必須アミノ酸、100 IU/mL ペニシリン、 100 μg/mL ストレプトマイシンおよび 2 mM L-グルタミン)。 続いて、滴定の 1 日前に DMEM に 5 × 104 細胞/mL で播種した VeroE6 細胞 (C. Drosten および M. Müller のご厚意により提供) に対してエンドポイント希釈アッセイを実行してウイルス力価を決定しました。 残りの TCID50 は、Spearman と Kärber に従って計算されました。

抗菌試験によれば、酢酸銀溶液と硫酸銅溶液がイオン対照として使用されました。 したがって、SARS-CoV-2 にさまざまな濃度の AgAc および CuSO4 溶液 (1.0、2.5、5.0、10、25、50 μg/mL) をスパイクし、室温で 1 時間および 24 時間インキュベートしました。 残りのウイルス力価をエンドポイント希釈アッセイとそれに続く TCID50 計算によって再度定量しました。

ICP-MS を使用して、対象表面との接触中にウイルスを含む媒体中に放出されるイオンの量を測定しました。 希釈は、直線検量線の高濃度部分を表す 1 ～ 100 ppb の検量範囲に調整されました。 校正測定に従って、サンプルは 2% HNO3 で酸性化されました。 複数の測定を可能にするため、または同じサンプルの希釈をさらに調整するために、300 μL の超高純度 69% HNO3 (Roth、Supra 品質) を加えて 10 mL のサンプル溶液を得、完全に混合して 10 mL まで満たして調整しました。酸濃度2%。 サンプルは、Thermo Fisher Scientific の iCAP RQ システムを使用して KED モードで分析されました。

抗菌効果の統計分析は、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置分散分析によって実行されました。 抗ウイルス効果の統計分析は、ダネット多重比較を使用した混合効果分析における二元配置分散分析によって実行されました。 p 値 ≤ 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開記事に含まれています。

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有用な提案や議論をしていただいた分子・医療ウイルス学科のメンバー全員に感謝いたします。 ICP-MS 測定については、ルール大学ボーフムの分析化学部長 (Wolfgang Schuhmann 教授) の Martin Trautmann 氏に感謝します。 ZGH は SEM へのアクセスを承認されます。

ルール大学ボーフム大学のオープンアクセス出版基金による支援に感謝します。 ES は、ノルトライン ヴェストファーレン州文化科学省の VIRus ALliance NRW (VIRAL) (助成金番号 323-8.03-151826) およびドイツ研究財団 (DFG、ドイツ研究財団) の助成を受けました。 . 458338078. SP は DFG によって資金提供されました – 助成金番号 458610711. オープン アクセスの資金提供は、Projekt DEAL によって実現および組織されました。

Toni Luise Meister、Jill Fortmann、Marina Breisch の著者も同様に貢献しました。

ルール大学ボーフム大学分子医学ウイルス学科 150、44780、ボーフム、ドイツ

トニ・ルイーゼ・マイスター、アイク・スタインマン、ステファニー・ファエンダー

ルール大学ボーフム大学、材料発見およびインターフェース担当議長 150、44780、ボーフム、ドイツ

ジル・フォートマン & アルフレッド・ルートヴィヒ

BG University Hospital Bergmannsheil Bochum、外科研究、ルール大学ボーフム、Buerkle de la Camp Platz-1、44789、ボーフム、ドイツ

マリーナ・ブライシュ、クリスティーナ・セングストック、マンフレッド・ケラー

ライプニッツ分析科学研究所 - ISAS - eV、Bunsen-Kirchhoff-Strasse 11、44139、ドルトムント、ドイツ

クリスティーナ・セングストック

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構想とデザイン: MB、CS、ES、MK、SP、AL。 データ収集と分析: TLM、JF、MB; データの解釈: TLM、JF、MB、CS、ES、MK、SP、AL。 執筆: TLM、JF、MB、CS、ES、MK、SP、AL

Stephanie Pfaender または Alfred Ludwig との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Meister, TL、Fortmann, J.、Breisch, M. 他ナノスケールの銅と銀の薄膜システムは、抗ウイルス特性と抗菌特性に違いを示します。 Sci Rep 12、7193 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-11212-w

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受信日: 2021 年 10 月 29 日

受理日: 2022 年 4 月 12 日

公開日: 2022 年 5 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11212-w

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