ラピッドとラベル

Scientific Reports volume 12、記事番号: 21413 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

この研究では、新しい刺激応答チオマーナノブラシ材料を使用して、リステリアモノサイトゲネスを検出するための高速かつラベルフリーの電気化学バイオセンサーの開発を実証します。ナノブラシは、ナノプラチナ (Pt) とアルギン酸チオメル (ALG チオメル) のワンステップ同時共蒸着によって開発されました。 ALG-チオマー/Pt ナノブラシプラットフォームは、電極の平均電気活性表面積を 7 倍に大幅に増加させ、アルギン酸塩の作動特性 (pH 刺激による浸透圧膨張) を維持しました。ブラシ作動中の誘電挙動は、アルギン酸塩の等電点の上下で正、中性、および負に帯電したレドックスプローブを使用して特性評価され、ALG-チオメル表面電荷が信号取得において重要な役割を果たしていることが示されました。 ALG チオマープラットフォームは、バイオセンシングアプリケーションのために、リステリアのインターナリン A タンパク質に対して選択的なアプタマーで生体機能化されました。アプタマーのローディングが最適化され、さまざまな細胞捕捉戦略が調査されました (ブラシを拡張した場合と折りたたんだ場合)。 ALG-チオマー/アプタマーが拡張立体構造 (pH > 3.5) にある場合に最大の細胞捕捉が起こり、続いて崩壊立体構造 (pH < 3.5) でのインピーダンス測定が行われます。低濃度の細菌 (5 CFU mL-1) が複雑な食品マトリックス (チキンブロス) から検出され、他のグラム陽性細菌 (黄色ブドウ球菌) に対する選択性試験により、これらの pH 値でもアプタマー親和性が維持されることが示されました。新しいハイブリッドソフトマテリアルは、これまでのリステリア菌バイオセンシングにおいて最も効率的かつ最速（17分）であり、サンプルの前処理を必要とせず、小分子または細胞をセンシングするための有望な新材料プラットフォームを構成します。

リステリアモノサイトゲネスは、環境 (土壌と水) に遍在する有毒な食中毒菌であり、米国では毎年数百人の死者を出しています 1,2。毎年、約 4,800 万件の食中毒が報告されており、その約 19% はリステリアモノサイトゲネスの感染によるもので、医療費、生産性の低下、人命の損失により、潜在的に 150 億ドルの経済的悪影響を及ぼします 3,4。筋肉痛、吐き気、下痢、嘔吐、悪寒などの症状を伴うリステリアモノサイトゲネスは、食中毒の中で最も致死性の高い病原菌の 1 つであり、高リスクの人の致死率は最大 30% です 5,6。これは妊婦にとって特に危険であり、通常は回復しても、赤ちゃんは生き残れない可能性があります2。

リステリアモノサイトゲネスは、低水分含量、高塩分条件、または一般的な冷蔵庫/冷凍庫ユニットに関連する温度で増殖する能力があるため、食品加工環境での監視が困難な病原体です7。インスタント食品中のリステリア・モノサイトゲネスに対するゼロトレランス規則は、米国食品医薬品局 (FDA)、米国農務省 (USDA)、および欧州連合 (EU) 1 によって実施されました。近年、リステリア汚染に関連した食品リコールの件数が増加しており8、汚染された食品を公衆の手に渡る前に特定できるリアルタイムの病原体検出方法の必要性がさらに高まっています。

総生菌数 (TVC)、ELISA (酵素免疫吸着法)、PCR (ポリメラーゼ連鎖反応) など、食品加工工場でリステリア菌を検出するための現在の最先端技術は、エラーや誤った測定値が発生しやすいものです。また、これを完了するには、高度な訓練を受けた人員を配置した高価な実験室環境が必要です9,10。これらの方法は感度 [約 100 CFU mL-1 の検出限界 (LOD)] に欠けているため、定性的検出ステップ 11 の前に細菌を濃縮/増幅するための 2 つの連続した濃縮ステップ (最長 48 時間) が必要となるため、これらの方法による検査結果は大幅に遅れます。 ]12,13 であり、培地、培養液、均質化組織などの複雑なサンプル中の低レベルの病原体を直接検出することはできません。

電気化学的センシング技術は、堅牢性、高速応答、使いやすさ、小型化、高感度、低い検出限界、少量の検体容量、濁ったサンプルの処理能力、ラベルフリー機能などの固有の利点により、さまざまな用途向けに広く研究されています12。 14. これらの特性は、使いやすい装置と簡単なサンプル前処理が必要な処理施設で環境サンプルや食品サンプルを分析する際に考慮することが重要です15、16。電気化学センサーの表面に金属ナノ粒子 (プラチナなど) および/またはポリマーを堆積すると、生体認識物質の固定化が改善されることに加えて、表面積および/または導電率が大幅に向上し、その結果、感度が向上し、捕捉が速くなり、センサーの性能が向上することが知られています。標的細菌の検出17．バイオセンシング分野における白金ナノ粒子の役割は、最近 Yu ら 18 によって再検討されており、高電流密度、高速物質輸送、センサーの重要な性能指標の向上につながる電極触媒特性の強化などの特性がまとめられています 19,20,21。、22。

アプタマーは一本鎖オリゴヌクレオチドであり、適切に選択され、正しい結合バッファーに適用された場合、標的に対して高い親和性を示します 23。アプタマーは、標的と露出した構造の相互作用を介して特異的に結合します24、25。アプタマーは、合成コストの低さ、再現性の高さ、熱安定性の高さ、さまざまな官能基（ビオチン化、チオール化など）の修飾および/または組み込み能力など、抗体に比べて多くの利点を持っています25、26。食品由来の病原体検出のためのアプタマーベースの技術に関する包括的なレビューでは、DNA アプタマーに結合した磁気ビーズや抗体アプタマーで官能化された光ファイバーセンサーを使用するプラットフォームを含む、光学的および電気化学的バイオセンサー (すなわち、アプタセンサー) の最近の開発が要約されています。汚染されたインスタント肉製品からのリステリア・モノサイトゲネス細胞の検出29。 Hills ら 30 および Oliveira ら 31 は、Ohk らによって発見されたアプタマーを使用した、個別のキトサンアプタマーナノブラシの作動を利用した、食品サンプル中のリステリア菌検出のための感知機構を報告しました 29。最近、Sidhu et al.32 は、リステリア属菌に対してこれと同じ DNA アプタマーで機能化されたプラチナの櫛型微小電極を使用したアプタセンサーを開発しました。オンサイトの灌漑用水分析用の粒子/沈殿物トラップにセンサーを組み込むことにより、野菜スープや水耕培地の検出を行います。

Hu et al. 33 による最近の総説にまとめられているように、センシング用途における作動のための刺激応答性ポリマーの使用は、近年ますます注目を集めています。刺激応答性ポリマーは、外部刺激に応答して溶解度、体積、および/または構造が大きく変化し、生体システムで観察される環境の外部変化に対する自然に生じる応答性を模倣するために使用されてきました 33,34,35。アルギン酸ナトリウムは、マンヌロン酸とグルロン酸の繰り返しを含む天然の無毒、生分解性、低コストの多糖類です。アルギン酸塩は、pKa が約 3.5 のアニオン性分子です。 pKa を超えるとアルギン酸塩は親水性となり、この pH を下回る環境では疎水性になります 36,37。これまでの研究では、細菌の捕捉を改善するためにポリマーの作動を使用しており 38、最近では、Hills ら 30 と Giacabassi ら 39 が、複雑な培地における病原体の捕捉と感知の両方のために刺激応答性ポリマーの作動を研究しました。これらの研究は、ポリマーの作動をマイクロスケールで制御することにより、ポリマーが伸長したときに病原体を捕捉でき、センサー表面でポリマーが折りたたまれた後にシグナル伝達が改善されることを実証することに成功しました30,39。しかし、これらの以前の研究では、センサーを製造するために金属ナノ粒子とポリマーを層ごとに堆積させて使用しており 30、40 、多段階の製造プロセスが必要でした。これらの以前の研究における最大の課題の 1 つは、ナノブラシを表面に結合し、その後に非特異的な架橋技術を使用する生体機能化であり、表面結合度対生体受容体の固定化の制御は困難でした。

ここでは、アプタセンサープラットフォームとしてのアルギン酸チオメルとナノプラチナのワンステップ共電着の開発に焦点を当てます。私たちは、このユニークなアルギン酸チオメル (ALG-チオメル) プラットフォームに基づいて、L. モノサイトゲネスを検出するための迅速なラベルフリーのバイオセンサーを開発します。これまでの研究では、アルギン酸塩とグラファイトや MnO2-C などの他の導電性材料の共電着が示されています 41,42 が、我々の知る限りでは、バイオセンシング用の ALG チオメルと白金の同時電着を示したのは今回が初めてです。ナノバイオセンサー開発のための新しく刺激的な研究分野を切り開きます。電圧、ALG-チオマー濃度、超音波電着サイクルのさまざまな組み合わせの下で ALG-チオマーの堆積条件を最適化し、最良の条件で電気活性表面積の最大 7 倍の増加を達成しました。我々の結果は、細胞捕捉が伸張したブラシ構造で発生し、センシングが折りたたまれたブラシ構造で発生したときに最高の信号対雑音比が達成されたことを示しています。最後に、ALG チオマー/Pt ナノブラシバイオセンサーは、食品マトリックス中のリステリアモノサイトゲネスを 5 CFU mL-1 という低濃度で、他のグラム陽性細胞の存在下で、検出を必要とせずに 17 分以内に選択的に検出できることを実証します。サンプルの前濃縮または酸化還元標識技術。

二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸カリウム、ヒドロキノン (C6H4(OH)2、塩化白金酸 (8% w/w)、およびヘキサアミンルテニウム(III) クロリド (Ru(NH3)6Cl3) は、Sigma-Aldrich Co. (St.ミズーリ州ルイス)、アルミナスラリー (0.05 μm) および多結晶ダイヤモンド微小懸濁液 (3 μm および 1 μm) は、Buehler (イリノイ州レイクブラフ) から購入しました。銀/塩化銀 (Ag/AgCl) 基準、プラチナ/イリジウム加工 (Pt) /Ir、直径 1.6 mm)、白金補助電極は BASinc (インディアナ州ウェストラファイエット) から入手、酢酸鉛 (30% w/v) は Fisher Scientific (ペンシルバニア州ピッツバーグ) から入手しました。 (3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド HCl (EDC) およびスルホスクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート (Sulfo-SMCC) は、Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) から入手しました。・3H2O) は Ward's Science (ニューヨーク州ロチェスター) から入手し、システイン塩酸塩一水和物およびフェリシアン化カリウム (K3Fe(CN)6) は JT Baker (ニュージャージー州フィリップスバーグ) から入手しました。アルギン酸ナトリウム塩 (低粘度)、N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS)、白金線 (99.95% Pt、直径 1.5 mm)、5,5'-ジチオビス-(2-ニトロ安息香酸) (エルマン試薬)、および 2- （モルホリノ）エタンスルホン酸）（ＭＥＳ）緩衝液は、ＡｌｆａＡｅｓａｒ（マサチューセッツ州ワードヒル）から入手した。 Ohk et al.29 が作成した、リステリア菌膜タンパク質インターナリン A (KD = 103 CFU/mL、47 DNA 塩基、および 15,008 g/mol) を標的とするアプタマーは、Gene Link Inc. (ホーソーン、ニューヨーク州) から入手しました。酵母抽出物、トリプシン大豆ブロス (TSB)、緩衝ペプトン水 (BPW)、およびトリプシン大豆寒天 (TSA) は、Becton, Dickson and Company (Sparks, MD) から入手しました。保存可能な野菜スープ (UHT、超高温処理) を地元の食料品店から入手しました。透析チューブ (DiaEasy™、3.5 kDa MWCO) は、Biovision (ミルピタス、カリフォルニア州) から入手しました。塩化カリウム (KCl) および塩化ナトリウム (NaCl) は、EMD Millipore Corporation (マサチューセッツ州バーリントン) から購入しました。硝酸カリウム (KNO3) は British Drug Houses (オンタリオ州、カナダ) から入手しました。トリス-エチレンジアミン四酢酸 (TE) 緩衝液 (pH 7.4) は、Quality Biological (Gaithersburg, MD) から入手しました。トリプトースリン酸ブロス (TPB) は HiMedia (ムンバイ、インド) から入手しました。

細菌培養物、リステリアモノサイトゲネス (ATCC 15313) および黄色ブドウ球菌 (ATCC 25923) は、American Type Culture Collection (バージニア州マナッサス) から入手し、それぞれ感受性および選択性試験の標的細菌および干渉細菌として使用しました。病原性微生物である黄色ブドウ球菌およびリステリア菌を用いた実験の実施には、国立衛生研究所によって設定されたバイオセーフティレベル 2 基準が使用されました。最初に-80°Cで保存したすべての細菌培養物を、同一かつ連続した二重転送によって増殖培地、L.モノサイトゲネスの場合はTPB、黄色ブドウ球菌の場合はTSBに移し、好気条件下で35°CS黄色ブドウ球菌およびL.モノサイトゲネス培養物は、それぞれトリプシン大豆寒天 (TSA) および 0.6% (w/v) 酵母エキスを含む TSA (TSAYE) 斜面上で 4 °C で最長 3 か月間維持されました。分析用に細菌培養物を準備するために、増殖培地への傾斜移動を実行しました。細菌サンプルは、最初にサンプルを BPW で段階希釈し、黄色ブドウ球菌とリステリア菌についてそれぞれ TSA および TSAYE 上にプレーティングすることによって数えられました。 35℃で48時間後。結果は CFU mL-1 として記録されました。

アルギン酸ナトリウムは、Jindal et al. 43 のようにカルボジイミド媒介カップリングを使用して、アルギン酸ナトリウムのカルボン酸基とシステインの第一級アミノ基の間のアミド結合形成によってチオール基末端を組み込むように修飾されました。この方法では、アルギン酸塩のカルボキシル基を EDC を用いて pH 6 で 45 分間活性化します。次に、塩酸システイン一水和物を重量比 2:1 (アルギン酸塩:システイン) で加え、pH 4 で 2 時間、続いて pH 6 でさらに 1 時間反応させました (製造手順については図 1 を参照)。反応は室温で継続的に撹拌しながら行った。

L.モノサイトゲネスに対して選択的なアプタマーで官能化されたALG-チオマー/Ptブラシの作製、生体機能化、およびセンシングの手順の概略図。まず、ALG-チオマーは、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド (EDC) 化学を使用したアルギン酸ナトリウムとシステインの反応に基づいて形成されます。次に、ALG チオマーと白金が作用電極上に同時に超音波電着され、ALG チオマー/Pt ブラシが SEM イメージングで表示されます。次に、ALG-チオマー/Pt ブラシは、カルボジイミド架橋化学を介してアプタマーで官能化されました。センシング戦略は、pH 変化に基づいて、ALG チオメル/Pt ブラシを折りたたんだ状態から伸長状態まで作動させることで構成されていました。細菌の捕捉は、伸長状態のブラシを使用して pH 7 で実行され、続いてブラシが pH 3 で折りたたまれたときに測定 (センシング) されました。

次に、溶液を透析（分子量カットオフ 3.5 kDa）して、アルギン酸塩-システイン複合体（ALG-チオマー）を単離しました。透析には、1 mM HCl (pH 4) に対して 2 日間、続いて 1 mM HCl および 1% (w/v) NaCl 中で 1 日間、さらに 1 mM HCl 中で 2 日間が含まれます (すべての溶液を 1 日 2 回交換しました)。。続いて、懸濁液を Labconco FreeZone 6 ユニット (Labconco、カンザスシティ、ミズーリ州、米国) で凍結乾燥しました (-50 °C、-0.120 mBar、48 時間)。続いて、ALG-チオメルをセンサー修飾に使用するまで窒素雰囲気下 5 °C で保存しました。

アルギン酸塩で達成された修飾の程度は、Thermo Fisher Scientific の指示に従ってエルマン分析を通じてチオール基の量を定量することによって決定されました44。簡単に説明すると、サンプルと 5,5'-ジチオビス-(2-ニトロ安息香酸)、つまりエルマン試薬を、EDTA (エチレンジアミン四酢酸) を含むリン酸緩衝液 (pH 8) 中で混合し、ブランク対照に対して 412 nm で吸光度を測定しました。分光光度計（Genesys 10S、Thermo Scientific、Waltham、MA）を使用して。システイン塩酸塩一水和物を使用して標準曲線を作成し、チオール濃度を定量しました（チオール基g-1のμmolとして表します）。

Taguchi et al.19 が開発した超音波電着法を使用して、アルギン酸塩と白金を白金/イリジウム作用電極 (製造元の指示に従って事前に研磨した) の表面に同時に蒸着しました (図 1)。この方法では、電源に白金ワイヤ (アノード) を接続し、作用電極 (カソード) で固定電位を 1 秒間印加し、その後堆積溶液に 1 秒間の超音波処理を繰り返すサイクルを繰り返しました。堆積溶液には、0.72% (w/v) の塩化白金酸、0.001% (w/v) の酢酸鉛、および異なる濃度 (0.05、0.075、および 0.1% w/v) の ALG チオメルが含まれていました。最適な堆積条件を決定するために、60、100、および 140 回の超音波電着サイクルに対する 1.5、5.75、および 10 V の電圧も評価されました。

電界放射型走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用して、電気化学実験に基づいた最良のブラシ堆積条件から形態を分析しました。 ALG-チオマー/Pt ブラシで修飾された電極を厚さ 5 nm の白金層でコーティングした後 [Cressington スパッタコータ 208 HR (英国ワトフォード)]、FEI Quanta 600 FEG (オレゴン州ヒルズボロ) で SEM 画像を撮影しました。）。表面イメージングには、加速電圧 10 kV で倍率 10,000 倍および 16,000 倍を使用しました。

選択された最適化されたブラシ堆積を使用してコーティングされた電極の表面化学は、CN10 電子銃および Mg/Al デュアル X 線銃を備えた Omicron ESCA + (Scienta Omicron、スウェーデン) で実行された X 線光電子分光法 (XPS) によって分析されました。。

バイオセンサー調製の各ステップ (アルギン酸白金の堆積、アプタマーのローディング、および細菌の検出) は、室温でサイクリックボルタンメトリー (CV) を使用して、3 電極セルシステム (動作電極、Ag/AgCl 参照電極、および白金補助電極) を使用して電気化学的に特性評価されました。 / または、CHI 600E ポテンショスタット/インピーダンスアナライザーを使用する Burrs ら 17 によって記載された電気化学インピーダンス分光法 (EIS) 法。 CV 試験は、1 mM KNO3 溶液中の 4 mM Fe(CN)63- 中で、50、100、150、および 200 mV/s のスキャン速度、650 mV スイッチング電位、および 10 秒の静止時間で実行されました。以前に報告されているように、CV を使用して、電流対走査速度の平方根 (ip 対 v1/2) の傾きを使用する Randles-Sevcik 理論によって電極の電気活性表面積 (ESA 単位 cm2) を取得しました 19,45 (を参照)詳細についてはサポート情報を参照してください)。 ESA 値は、最良の堆積パラメーター (ALG チオマー/プラチナナノブラシ堆積で説明されているように、ALG チオマー濃度、電圧、および超音波電着サイクル数) を決定するために使用され、また、ブラシの作動を特徴付け、アプタマー負荷濃度を決定するために使用されました。 (詳細についてはサポート情報を参照してください)。

作動試験には、負に帯電したプローブ (KFeCN63-)、中性プローブ (C6H4(OH)2)、および正に帯電したプローブ Ru(NH3)63+ を使用しました。酸化還元プローブ溶液のpHは、1M HClまたはNaOH溶液を使用してpH 7またはpH 3に調整した。 CV テスト中に酸化還元溶液の pH を監視し、報告された pH が 0.5 pH 単位を超えて変化しないことを確認しました。また、EIS を使用して、リン酸緩衝食塩水 (PBS) 中の 103 CFU mL-1 の一定のバックグラウンドリステリア濃度の存在下で作動テストを実行し、ブラシの伸長構造と崩壊構造の間の最も効率的な捕捉および測定戦略を決定しました。

EIS を使用して、101 ～ 106 CFU mL-1 の範囲の濃度で細菌に曝露したときのバイオセンサーの検出限界 (LOD)、検出範囲、および感度を決定しました (標準曲線)。アプタマーを用いたALG-チオマー/Ptブラシの機能化手順の詳細については、サポート情報を参照してください。分析は、初期 DC 電位 0 V、AC 振幅 100 mV、周波数範囲 1 ～ 100,000 Hz で実行されました。感受性試験は最初に PBS 中で実施され、次に再び市販の滅菌野菜ブロス中で実施されました。ボード線図 (インピーダンス対周波数) から、固定カットオフ周波数でのインピーダンス値を使用して、インピーダンス (オーム) 対細胞濃度 (log CFU mL-1) からなる検量線を作成しました。検量線 (R2 > 0.97) から、直線部分の傾きを用いて対象細菌に対する感度を求め、3σ 法を用いて検出限界 (LOD) を計算しました39。インピーダンスの変化 (\(\mathrm{\Delta Z}= {Z}_{細菌}-{Z}_{\, 細菌}\)) を使用して、媒体に依存しない電極の性能を示しました。リステリア・モノサイトゲネスに対する選択性は、PBS および滅菌野菜ブロス中の同濃度の別のグラム陽性菌 (黄色ブドウ球菌) の存在下での感度と LOD を測定することによって評価されました。

独立した実験の結果は少なくとも 3 回実行され、平均 ± 標準偏差として表されました。 SPSS ソフトウェアを使用して統計分析を実行しました。 ANOVA (一元配置分散分析) を使用して有意性を検定し、p < 0.05 レベルで表しました。有意に異なる平均値が Tukey テストによって分離されました。

ALG-チオマーの反応効率は、エルマン分析によって最初に評価されました。得られた結果は、ポリマーのチオール基 g-1 が 1050 ± 200 μmol であり、Jindal ら 43 が同様の手順で提示したチオール含有量 324.54 μmol g-1 より約 3 倍高かった。私たちのアプローチでは、EDC (カルボジイミド化合物) がアルギン酸塩のカルボン酸基と反応して活性 O-アシルイソ尿素中間体を形成し、これがシステインの一級アミノ基に置き換えられ、元のカルボキシル基とアミド結合を形成します (図を参照) . 1）。 EDC が NHS をカルボキシルに結合させ、O-アシルイソ尿素中間体よりもかなり安定な NHS エステルを形成するため、効率を向上させるために N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) を反応に含めることができます 46。 Marcano と Sabino47 は、EDC との活性化反応に NHS を含めることにより、1939 μmol g-1 というより高い値のチオール基を報告しました。ただし、このアプローチでは架橋する可能性のある追加の官能基が導入され、ブラシの作動を制御する能力が低下し、実験誤差が生じます。

エルマン分析におけるチオール基の存在は、サンプル中に硫黄が存在することを示していますが、チオール基は大気中の酸素にさらされると酸化されやすいため、硫黄の状態 (反応性スルフヒドリル基または酸化) に関する情報は得られません。ジスルフィドのような結合または架橋 (-S-S-) 形成の可能性があります47。

XPS 分析は、電気化学的応答に関連する最適な堆積条件の化学結合を特徴付けるために実行されました (詳細な結果と考察については裏付け情報を参照してください)。 ALG-チオマー/Ptブラシ堆積のXPSスペクトル（図2a）は、ALG-チオマーとPtの両方の成分の効果的な堆積を示し、ALG-チオマーとPtからのC 1s、O 1s、N 1s、およびS 2pの特徴的なピークを示します。プラチナから4f。 399 eV の N 1s ピークは、システイン金属錯体の範囲内に収まります 48。 400 eV の結合エネルギーは、アミン基の存在 40 またはシステイン 49 に関連している可能性があります。同様に、Wang et al.50 および Li et al.51 は、本研究と同じ範囲に小さな S 2p および N 1s ピークを提示し、XPS を比較することによりカーボンドット (クエン酸三ナトリウム-システイン複合体) 上にこれらの成分が存在することを示しています。純粋なシステインを含むフルスペクトル）とアルカンチオールの金属 Pt 上の自己組織化単分子層。 164 eV の S 2p 結合エネルギー (図 2b) は、チオール 52 またはその金属イオンへの配位の特徴です 48。 162.5 eV (S 2p) のピークも、金属と硫黄の結合で予想される範囲内にあります 52。 Yang と Agrios53 は、本研究で得られた値 (162.5 eV および 164 eV) よりわずかに低い値 (161.84 eV および 163.04 eV) で Pt 修飾 4-メルカプト安息香酸の S 2p 領域の二重項を Pt の形成に関連付けました。 –Sの絆。 Castner ら 54 も、金表面にチオラート種として結合した硫黄原子と一致する 161.9 eV の結合エネルギーを報告しました。 168.5 eV 付近の S 2p ピークは、酸化硫黄の存在によるものである可能性があります 48,53。 Pt 4f スペクトル（図 2c）は、S 結合した Pt に対応する 71 eV と 74.3 eV の 2 つのピークを示し、これは S 原子と接触した Pt に関する文献報告と一致しています 53、55。 Romanchenko et al.56 は、結合エネルギーを Pt0 金属ナノ粒子に 71.5 eV、Pt(IV)-S 化合物に 74 eV と割り当てました。これは、本研究でも当てはまる可能性があります。(1) Pt は、ナノ粒子上に直接堆積している可能性があります。 (2) 塩化白金酸を使用した電着には、Pt(IV) カチオンとその Pt057 への還元が含まれます。全体として、図 2 に示す XPS スペクトルは、Pt ナノ粒子と ALG チオメルの S 原子間の結合を示しています。

X 線光電子分光法 (XPS) 分析。 (a) 調査スペクトル、(b) S 2p スペクトル、(c) Pt 4f スペクトル。ALG チオマーと Pt の両方が電極上にうまく共蒸着されたことを示しています。滑らかな曲線を伴う実線は、S 2p および Pt 4f ピークを識別するために使用される XPS Peak ソフトウェアからのものです。

電気化学的応答に関連する最良の堆積条件におけるナノプラチナおよびアルギン酸塩ブラシの形態を図 3 に示します (詳細はサポート情報の結果と考察を参照)。 ALG チオマー / Pt ブラシ堆積では、並置された回転楕円体 (ブラシ末端ノード) が形成されました。直径は 80 ～ 400 nm で、表面全体にランダムなカリフラワーの形の構造が分布した均一なコーティングが施されています。アルギン酸塩と MnO2-C 複合材料を同時に電着した場合、より滑らかではあるが同様の構造が Chen ら 42 によって提示されました。また、より多孔質で三次元ではあるものの、同様の回転楕円体構造が、還元された酸化グラフェン層と白金層上に PNIPAAm ブラシを堆積することで、Giacabassi ら 39 によって示されました。 Giacabassi et al.39 によって記載された PNIPAAm ブラシと同様に、ALG-チオメル/Pt ブラシの電着により、シャフトとノードのサイズが均一に分布した均一なブラシが形成されました。 Taguchi et al.19 によれば、パルス超音波電着法は電極表面への物質移動の増加を促進し、その結果均一な材料の析出が得られます。共蒸着された ALG-チオマー複合体は非常に大きなポリマー材料であり、これは Giacabassi らによっても観察されているため、本研究で得られる比較的大きく滑らかな構造は予想されます 39。回転楕円体の形状により表面積が増加し、その結果、裸の電極と比較して電気化学的表面積が大幅に増加します (サポート情報の結果と考察を参照)。さらに、以前に Giacovassi et al.39 および Hills et al.30 によって報告されているように、ブラシの作動と組み合わせたブラシ構成により、アプタマーの培地への曝露が増加し、その後の細菌の結合が増加すると予想されます (結果セクション「ALG-」を参照)。チオマー/Pt ブラシの作動とリステリア属菌の捕獲」および「バイオセンサー性能テスト」)。センシング性能に対する形態の重要性を考慮して、形態に対するさまざまな蒸着パラメータの影響についてのさらなる調査を実行する必要があります。

10 kV、(a) 10,000 倍、(b) 16,100 倍の倍率での ALG-チオマー/Pt ブラシの走査型電子顕微鏡画像。電極表面上の均一なブラシの形成と堆積が示されており、終端ノードの範囲は 80 ～ 400 nm です。直径で。

アルギン酸塩は、pKa 値が 3.2 ～ 4 (それぞれグルロン酸とマンヌロン酸) の酸性ポリマーです 37,58。通常、アルギン酸塩の pKa 未満ではカルボン酸基が COOH の形でプロトン化され、ポリマーは崩壊します。溶液の pH が増加すると、COOH は COO- にイオン化され、これらの基間の静電反発によりポリマーが伸長します 37、59、60。アルギン酸塩のpH刺激作動特性がその修飾によって影響を受けるかどうかをテストし、電極表面での作動中の静電相互作用を特徴付けるために、3つの異なる酸化還元プローブを使用してCVテストを実行し、ESA値を計算しました（図4a）。。負に帯電したプローブ (KFeCN63-)、中性プローブ (C6H4(OH)2)、および正に帯電したプローブ Ru(NH3)63+ を使用しました。さらに、CV は、ポリマーの pKa よりも低い、および高い pH 3 および 7 でそれぞれ 3 回の繰り返しサイクルで実行されました (図 4a)。

(a) ALG-チオマー/Pt ブラシの pH 3 と pH 7 の間の 3 つの作動サイクル中の、さまざまなレドックスプローブを使用した静電相互作用: 正に帯電したプローブ (Ru(NH3)63+、負に帯電したプローブ (KFeCN63-)、および中性プローブ (C6H4(OH)2) (b) 400 nM アプタマーで官能化され、さまざまな捕捉/測定のさまざまなカットオフ周波数で 103 CFU mL-1 のリステリアモノサイトゲネスに曝露された ALG-チオマー/Pt ブラシの平均総インピーダンス作動に基づく戦略。「EX」は伸長状態 (pH 7)、「COL」は折りたたまれたブラシ状態 (pH 3)、「キャップ」は細胞捕捉、「meas」は測定を示します。エラーバーは少なくとも 3 回の反復の算術平均の標準偏差。異なる文字は有意に異なる平均を表します (p < 0.05)。

図4aに示すように、pKa（pH 7）を超えると、アルギン酸カルボン酸基が負に帯電するため、電荷反発/立体障害によりKFeCN63-プローブの電子輸送が減少します。中性プローブ (C6H4(OH)2) を使用すると、電子移動はあまり影響を受けませんが、アルギン酸塩のカルボン酸基 (COO-) 間の分子内静電反発により、ある程度の膨潤が起こる可能性があります 59。 Ru(NH3)63+ プローブでは、静電相互作用によりピーク電流と ESA が増加します。 pKa (pH 3) 以下では逆が起こり、負のプローブでは電子移動が促進され、ピーク電流と ESA が増加しますが、正のプローブではピーク電流と ESA が減少します。静電相互作用または反発による ESA の増加または減少の同様の挙動は、同じ酸化還元プローブを用いたキトサンの作動に関して Oliveira ら 31 および Hills ら 30 によっても観察されています。動作を繰り返すと、ピーク電流と ESA は繰り返し間でわずかに変化しました (図 4a)。ただし、変化率は有意ではなく、観察可能なヒステリシスはありませんでした。これは、ALG-チオメル/Pt ブラシの作動が可逆的であり、折りたたまれた状態から伸長された状態まで複数回 (少なくとも 3 回) 繰り返すことができることを示しています。これらの結果は、繰り返し間の作動ヒステリシスを報告した、それぞれキトサンと PNIPAAm のブラシ作動に関する Hills ら 30 と Giacovassi ら 39 からの改善です。

図1に示すように、ALG-チオマー/Ptブラシは、カルボジイミド架橋を介して400 nMのアミノ末端アプタマーで官能化することによりアプタセンサーに変換されました（詳細についてはサポート情報を参照）。標的細菌がアプタマーに結合すると、インピーダンスの増加として測定される電極表面での電子伝達が減少するという原理に基づいて、EIS を使用して作動テストを実施し、L. monocytogenes を捕捉および感知するための最適な pH 値を決定しました。。これらの実験では、PBS 中の 103 CFU mL-1 の一定濃度の L. monocytogenes を使用しました。図4bでは、pH > 3.5での拡張したブラシ構造は(EX)として示され、pH < 3.5での崩壊したブラシ構造は(COL)として示され、細胞捕捉状態は(キャップ)で示され、電気化学的測定ステップは(meas) によって記録されます。拡張構造（pH 7）で細胞を捕捉し、崩壊状態（pH 3）でセンシングすると、すべてのカットオフ周波数で最高のインピーダンス値（p < 0.05）が得られたため、センシング効率が向上しました（図S3のボード線図も参照）サポート情報）。拡張型での標的細菌の最適な捕捉は、ブラシが収縮する pH 3 と比較して、試験溶液とのより高い接触面積とアプタマー細胞相互作用の確率の増加、および受容体結合部位に関連している可能性があります。 ) にアクセスできない可能性があります。この捕捉戦略に関する我々の以前の研究と同様に、センシングステップ中に細胞がポリマーマトリックスに絡みつく可能性が高く、アプタマーと標的の結合はもはや細胞捕捉のメカニズムではなく、むしろナノブラシの崩壊中に絡み合う可能性がある。この検出プラットフォームの特異性は、pH 7 でのアプタマーとターゲット間の初期親和性 (拡張 ALG チオマーナノブラシ) に根ざしており、pH 3 での崩壊はアプタマーの二次構造変化を引き起こす可能性がありますが、ポリマーマトリックスに細胞も捕捉します。

捕獲戦略に関するこの発見は、病原体検出のための EX/cap → COL/meas 戦略を使用したより高いセンシング効率も示した Hills ら 30 および Giacabassi ら 39 によって報告された結果と一致しています。さらに、システインによるアルギン酸塩の修飾とそれに続くそのカルボニル基を使用したアプタマー結合は、通常、高度に負に帯電した（ほとんどの条件下で）L. monocytogenes の膜に対する静電反発を引き起こすアルギン酸塩の負電荷を中和すると考えられます61。この細菌捕捉方法は、ポリマーマイクロ流体デバイスに統合された3D磁気トラップに基づいて免疫磁性ナノ粒子に合わせて調整された高勾配磁気分離デバイスを開発したMalicらによる方法62など、文献で報告されている他の方法と比較してかなり単純です。 L.モノサイトゲネスの磁気捕捉と放出。

生体組織の誘電特性は、次の 3 つの分散によって特徴付けられます。(a) 膜などの組織界面に関連して、低周波で発生するα分散。 (b) 細胞膜、タンパク質、その他の有機高分子の分極によって引き起こされる、高周波でのβ分散。 (c) 水分子の分極に関連するマイクロ波周波数での γ 分散。細胞膜は、低周波では絶縁バリアとして機能し、抵抗経路を示しますが、高周波では高い静電容量を示します。したがって、EIS 作動データはカットオフ周波数 (CF) を決定するために使用されました。この分析は、生体組織のアルファ周波数分散領域に対応する 1 ～ 50 Hz の周波数範囲で実行されました。最大インピーダンス信号（p < 0.05）は、1 HzのCFで観察され（図4b）、次のセクションで複雑な培地および細菌の混合物におけるアプタセンサーの主要性能指標（KPI）を決定するために選択されました。

400 nMのアミノ末端アプタマーで官能化されたALG-チオマー/Ptブラシで堆積された電極のL.モノサイトゲネスを検出する能力をEISによって評価した。バイオセンサーの機能化の詳細と、ALG-チオマー / Pt ブラシへの最適なアプタマー負荷濃度の結果については、サポート情報を参照してください (図 S2)。バイオセンサーの分野では、EIS は、標識 (蛍光色素、酵素、酸化還元、放射性化合物など) を必要とせずにトランスデューサー表面上の結合イベントを検出するのに特に便利です 63。インピーダンスという用語は、界面が（受容中心の占有により）電荷の移動に対する電気的障害を提供し、界面に結合するターゲットの関数として増加するために生じ、これによりラベルフリーのバイオセンシングが可能になります64。細菌の存在によって引き起こされるインピーダンス差 (100 ～ 103 CFU mL-1 の範囲) は、EX/cap → COL/meas 戦略 (pH 7 → 3) を使用して得られました。合計のテスト時間は 17 分で、これには細菌捕捉に 15 分、EIS 測定に 2 分が含まれていました。ボード線図は 1 Hz ～ 100 kHz の周波数範囲にわたって表示されます。挿入図は、より低い周波数範囲 (1 ～ 5 Hz) を拡大したものです。図 4b に示すカットオフ周波数 (CF) 解析に基づいて、すべての校正曲線は 1 Hz の CF のボード線図からのデータを使用して作成されました。

図 5 は、L. モノサイトゲネス (y = 39.21x + 631.64、R2 = 0.99) および黄色ブドウ球菌の存在下 (y = 69.34x + 719.16、R2 = 0.98) に対して校正された ALG-チオマー/Pt/アプタマーナノハイブリッド電極を示しています。選択性試験は、グラム陽性菌としてのリステリア菌との類似性、および同様のサイズ (0.5 ～ 2 μm) に加え、両方とも既知の食中毒病原体であることから、黄色ブドウ球菌を用いて実施されました。試験溶液に等濃度の黄色ブドウ球菌を添加しても、LOD (L. モノサイトゲネス単独では 4.5 ± 0.8 CFU mL-1、両方では 5.7 ± 2.1 CFU mL-1) に対する有意な干渉は見られませんでした (p > 0.05)。細菌) は、センサーと黄色ブドウ球菌の間に交差反応がないことを示しています。感度は、L. monocytogenes 単独の場合の 39.21 ± 2.61 Ω/log(CFU mL-1) から、黄色ブドウ球菌も存在する場合の 69.34 ± 2.79 Ω/log (CFU mL-1) まで増加しました (p < 0.05)。線形範囲も、PBS 中の L. monocytogenes のみの 101 ～ 106 CFU mL-1 から、細菌混合物中の 101 ～ 105 CFU mL-1 に変化しました。 Ohk et al.29 は、同じアプタマーを光ファイバーバイオセンサーで使用してリステリア属菌を検出し、103 CFU mL-1 の LOD を示しました。最近、Oliveiraら31は、同じアプタマーを使用して、PBS中および黄色ブドウ球菌の存在下でのL.モノサイトゲネス単独に関する現在の研究と比較して、それぞれ2.5および2.6 CFU mL-1という同様のLODを示した。キトサン/プラチナブラシの作動を使用します。抗体センサーはプロテイン A キャリアでもある黄色ブドウ球菌に対して偽陽性反応を起こしやすいと報告されていますが、本研究で使用されたアプタマーはリステリア菌に対して選択的であることが証明されました 29。このアプタマーは、病因に関与する主要な侵入タンパク質の 1 つである表面タンパク質インターナリン A を標的とします 29。このタンパク質は、ブドウ球菌属および連鎖球菌属65のメンバーで同定された内部反復を有する特定の細胞壁タンパク質と構造的に類似しているという事実にもかかわらず、本結果は、このアプタマーがリステリア・モノサイトゲネスに対して選択的であり得ることを裏付ける。

(a) L に曝露した 400 nM アプタマーで機能化した ALG チオマー / Pt ブラシセンサーの、1 ～ 100,000 Hz の周波数範囲にわたる代表的なボード線図 (挿入図は 1 ～ 5 Hz の低周波数範囲を考慮して拡大したもの) PBS中のL.モノサイトゲネスおよび(b)PBS中のL.モノサイトゲネス+黄色ブドウ球菌。 (c) 検量線 (1 Hz での総インピーダンス変化対細菌濃度の対数)。エラーバーは、少なくとも 3 回の反復の算術平均の標準偏差を表します。

PBS 中の細菌を検出する ALG-チオマー/Pt ブラシセンサーの能力を確認した後、センサーを食品中でテストして、標的細菌に対する選択性と、食品成分の干渉によって感度が影響を受けるかどうかを確認しました。チキンブロス (図 6、y = 42.59x + 1320.93、R2 = 0.98) を使用しました。これは、他の成分の中でも特に、偽陽性シグナルを引き起こす非特異的吸着を介してバイオセンサーと相互作用する可能性のある炭水化物やタンパク質が含まれているためです。チキンブロス中のリステリア菌に対する感受性は 42.59 ± 2.35 Ω/log(CFU mL-1)、LOD は 4.4 ± 0.8 CFU mL-1 で、どちらも PBS での結果と同様 (p > 0.05) でした。これらの結果は、アプタマーが複雑な食品マトリックス中でもリステリア・モノサイトゲネスに選択的に結合できることも示しています。同じアプタマーを使用して、Hills ら 30 は、キトサンの pH 応答に基づいて作動する、層ごとに還元された酸化グラフェン/ナノ白金/キトサンブラシ電極を使用した野菜ブロス中で、9.1 CFU mL-1 というわずかに高い LOD を報告しました。

(a) 1 ～ 100,000 Hz の周波数範囲にわたる代表的なボード線図 (挿入図は 1 ～ 5 Hz の低い周波数範囲を考慮して拡大したもの) および (b) 検量線 (1 Hz での総インピーダンス変化対細菌の対数)濃度）は、チキンブロス中でリステリア・モノサイトゲネスに曝露された400nMアプタマーで機能化されたALG-チオマー/Ptブラシセンサーについてのものです。エラーバーは、少なくとも 3 回の反復の算術平均の標準偏差を表します。

アプタマーの結合有効性とバイオセンサーの性能に対するその役割は、アプタマーのないALG-チオマー/PtブラシセンサーをPBS中の濃度を増加させたリステリア・モノサイトゲネスに曝露することによってさらに評価されました（サポート情報、図S4を参照）。得られた LOD は 28.88 ± 1.31 CFU mL-1 で、感度はそれぞれ 23.27 ± 7.87 Ω/log(CFU mL-1) でした。以前に提示されたアプタマーを含むセンサーのパフォーマンスは、アプタマーを含まないセンサーと比較した場合、有意に (p < 0.05) 優れていました。ナノブラシ上に細菌がランダムに捕捉されるにもかかわらず、これらの LOD と感度の結果は、L. monocytogenes に選択的に結合し、センサーの性能を大幅に高めるというアプタマーの役割を示しています。さらに、これらの結果は、ALG-チオメル/Pt ブラシを適用して細菌を捕捉するための作動プロトコルの有効性をさらに実証しており、これは食品安全モニタリング (つまり総細菌数) の最初のステップとして使用できる可能性があります。

アルギン酸塩は、その生体適合性と、抗生物質、腫瘍細胞、血液分析などの検出などの生体認識剤のカプセル化と固定化に役立つ官能基により、バイオセンサー用途での人気が高まっています66,67。水の毒性を監視するためにカプセル化された細菌を使用した例もあります 68,69 が、細菌の検出に関する報告は依然として少ないです。例えば、Kikuchi et al.70 は、母乳中の検出のために大腸菌のβ-ガラクトシダーゼ酵素によって切断される色素をカプセル化するためにアルギン酸塩を使用し、2 ～ 8 時間のインキュベーション後に 102 CFU mL-1 の LOD を報告しました。

さまざまな食品サンプルまたはバッファー中のリステリア菌検出用の現在のバイオセンサーをまとめたものを表 S1 に示します (裏付け情報を参照)。 Liuら71は、アプタマー官能化磁性ナノ粒子（前濃縮プローブとして）およびアプタマー官能化アップコンバージョンナノ粒子（蛍光シグナルプローブ）を使用することにより、68～68×106 CFU mL-1の範囲のL.モノサイトゲネスを検出する良好な結果を発表した。一緒に; ただし、この手順には 1 時間のインキュベーションと前濃縮ステップが含まれます。 Sidhu et al.72 は、本研究で使用したのと同じアプタマーで機能化したプラチナ櫛型アレイ微小電極を提案し、リステリア属菌の LOD が 5.39 CFU mL-1 であると報告しました。 PBS 中でも 17 分間の検出が可能です。別の研究では、Sidhu et al.32 は、アプタマーで機能化された同じ白金櫛型アレイ微小電極を適用して、リステリア属菌の検出による迅速なオンサイトフローを実現しました。スマートフォンベースのポテンシオスタットを使用した灌漑用水および流動条件での実験で、報告された LOD は 48 CFU mL-1 でした。当社のセンサーは、クリーンルームでの製造が不要で、より簡単かつ迅速に製造できるなど、文献に記載されているほとんどのセンサーに比べていくつかの利点を備えています。標識や細菌の事前濃縮は必要ありません。検出時間が短く、これまでのリステリア菌センシング用プラットフォームの中で最も効率的であり、食品の安全性に関連する低い検出限界と広い線形センシング範囲を備えています。

実際の食品サンプル中の特定の病原体の検出には、複雑な多成分構造や他の微生物（病原性および非病原性）の存在による、サンプル中の不純物によるバックグラウンドシグナルが存在するため、時間と手間がかかります。濃縮処理と実験室環境。この研究では、アルギン酸チオメル/白金ナノブラシのワンステップ製造プロセスを使用した、高感度、選択的、および製造が簡単なインピーダンス測定アプタセンサーについて報告します。我々は、ナノプラチナとアプタマーで修飾されたALGチオマーがアルギン酸塩の刺激応答特性を維持しながら、アプタマー結合により標的細菌であるL.モノサイトゲネスに対する親和性も維持していることを初めて示した。 ALG-チオメル/Pt ブラシを作動させると、折りたたまれた状態でのマトリックスの捕捉により、細菌の検出が大幅に向上しました。 10 ～ 106 CFU mL-1 の線形検出範囲と、食品サンプル中の 5 CFU mL-1 の検出限界は、食品安全分析に関連するレベルをカバーしており、食品メーカーは汚染食品のリコールによる経済的および公衆衛生への影響を軽減できます。。文献で入手可能な他の方法と比較して、このセンサーはリステリア・モノサイトゲネスの最も効率的な捕獲機構の一つであり、さらに、簡単なワンステップ製造、標識不要、プレインキュベーションや濃縮の必要がなく、応答が不要であるなどの他の利点も備えています。時間は17分。この研究で提示された結果は、開発されたセンサープラットフォームが食品安全監視アプリケーションでの使用に適していることを示しています。さらに、この ALG チオマープラットフォームは、他の食中毒病原体の検出や小分子センシングについてさらにテストすることができ、複雑なマトリックス中の標的の検出が大幅に進歩します。

この研究で提示されたデータは、対応する著者からのリクエストに応じて入手できます。

サマセット、VS 環境バイオセンサー (InTech、2011)。

Google Scholar を予約する

FDA。米国食品医薬品局: Bad Bug Book、食品由来の病原性微生物と天然毒素 (FDA、2012)。

Google スカラー

Hoffmann, S.、Maculloch, B. & Batz, M. 米国で発生した主要な食中毒の経済的負担、EIB-140 (米国農務省経済調査局、2015 年)。

Google スカラー

米国食品医薬品局。報告可能な食品登録: 検査リソースの目標設定と異物混入のパターンの特定に関する 5 年間の概要 (米国食品医薬品局、2016)。

Google スカラー

ラマスワミー、V. et al. リステリア菌: 疫学と病因の概説。Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．イムノール。感染する。 40、4–13 (2007)。

CAS Google スカラー

フライ、DM et al. リステリア菌に汚染された総菜肉に関連した発熱性胃腸炎の発生。Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．イムノール。感染する。 90005、943–949 (2002)。

Google スカラー

De Noordhout、CM et al. リステリア症の世界的負担：体系的レビューとメタ分析。ランセット感染症 14、1073–1082 (2014)。

記事 Google Scholar

FDA。米国食品医薬品局: リコール、市場からの撤退、および安全性に関する警告。（2021年）。 https://www.fda.gov/safety/recalls-market-withdrawals-safety-alerts。 2021 年 2 月 10 日にアクセスしました。

Lavecchia, T.、Tibuzzi, A.、Giardi, MT 機能性食品の安全性と分析のためのバイオセンサー。栄養補助食品のバイオファーム: バイオセンサーによる機能性食品と安全性管理、267–281 (2010)。

Velusamy, V.、Arshak, K.、Korostynska, O.、Oliwa, K. & Adley, C. 食品由来の病原体検出の概要: バイオセンサーの観点から。バイオテクノロジー。上級 28、232–254 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

Hitchins, A.、Jinneman, K. & Chen, Y. 細菌分析マニュアル第 10 章: 食品および環境サンプル中のリステリアモノサイトゲネスの検出、および食品中のリステリアモノサイトゲネスの列挙。（2017年）。

Vanegas, DC、Claussen, J.、Mclamore, E. & Gomes, C. 微生物病原体検出戦略。農業、食品、生物工学百科事典、1–4 (CRC Press、2017)。 https://doi.org/10.1081/E-EAFE2-120051868。

Vanegas, DC、Gomes, C. & Mclamore, ES 食品媒介細菌を間接的にモニタリングするためのバイオセンサー。バイオセンス。 J. 5、1–3 (2016)。

記事 Google Scholar

Baraket、A. et al. サイトカイン検出用の完全に統合された電気化学バイオセンサープラットフォームの製造プロセス。バイオセンス。バイオ電子。 93、170–175 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

マクラモア、ES et al. バイオセンサーの FEAST: 北米における食品、環境、農業センシング技術 (FEAST)。バイオセンス。バイオ電子。 178、113011 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

マクラモア、ES et al. SNAPS: 検出および意思決定支援システムのためのセンサー分析ポイントソリューション。センサー 19、4935 (2019)。

記事 ADS CAS Google Scholar

バーズ、SL et al. バイオセンシングのためのグラフェン-ヒドロゲルハイブリッドバイオナノ複合材料の比較研究。アナリスト 140、1466–1476 (2015)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Yu、H.ら白金電気化学バイオセンサーの実用化の最近の進歩。フロント。化学。 9、677876 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

田口正人他 PulSED: 電流測定バイオセンサーの性能を向上させるためのフラクタルナノプラチナのパルス音波電着。アナリスト 141、3367–3378 (2016)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Claussen、JC et al. 電気化学的バイオセンシングのための多層グラフェン花びらナノシート上のプラチナナノ粒子のナノ構造化。上級機能。メーター。 22、3399–3405 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Zeng、R. et al. 単一原子プラチナナノ触媒は、酵素-DNA超分子構造により触媒効率を向上させました。ナノエネルギー 74、104931 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Hrapovic, S.、Liu, Y.、Male、KB & Luong、JHT プラチナナノ粒子とカーボンナノチューブを使用した電気化学バイオセンシングプラットフォーム。アナル。化学。 76、1083–1088 (2004)。

記事 CAS Google Scholar

Acquah, C.、Agyei, D.、Monney, I.、Pan, S.、Danquah, M. 食品安全におけるアプタマーセンシング。食品管理とバイオセキュリティ。食品生物工学ハンドブック (Vol. 16) (Grumezescu, H. & 編) 259–277 (Elsevier、2018)。

Teng, J. et al. 食品由来の病原体検出におけるアプタマーベースの技術。フロント。微生物。 7、1426 (2016)。

記事 Google Scholar

Acquah, C. et al. パンデミックを迅速に監視するためのアプタメリックセンシング技術の導入。クリティカル。バイオテクノロジー牧師。 36、1010–1022 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

タン、SYら。アプタマーの SELEX 修飾と生物分析技術: ターゲット結合の特性評価。クリティカル。アナル牧師。化学。 46、521–537 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

ケルカイネン、RM 他食品産業における安全性と品質保証のためのアプタマー: 病原体の検出。内部。 J.食品科学。テクノロジー。 46、445–454 (2011)。

記事 Google Scholar

Torres-Chavolla, E. & Alocilja, EC 微生物およびウイルス病原体を検出するためのアプタセンサー。バイオセンス。バイオ電子。 24、3175–3182 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

Ohk、SH、Koo、OK、Sen、T.、山本、CM、Bhunia、AK 食品からリステリアモノサイトゲネスを特異的に検出するための、抗体アプタマー機能化光ファイバーバイオセンサー。Ｊ．Ａｐｐｌ．微生物。 109、808–817 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

Hills、KD、Oliveira、DA、Cavallaro、ND、Gomes、CL & McLamore、ES 病原体感知のためのキトサン-アプタマーナノブラシ境界の作動。アナリスト 143、1650–1661 (2018)。

記事 ADS CAS Google Scholar

オリベイラ、DA、アルタワブ、S. & マクラモア、ES リステリア菌検出用の刺激応答性キトサン白金ブラシのワンステップ製造。バイオセンサー 11、511 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Sidhu, R. et al. リステリア属菌のフロースルー検出用の平面櫛形アプタセンサー水耕栽培レタス成長培地。センサー 20、5773 (2020)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Hu、L.、Zhang、Q.、Li、X.、Serpe、MJ 材料の地平線と作動。メーター。 Horizons 6、1774 ～ 1793 年 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Ju、HK、Kim、SY & Lee、YM アルギン酸塩とポリ (N-イソプロピルアクリルアミド) で構成されるセミ IPN および櫛型グラフトハイドロゲルの pH/温度応答性挙動。ポリマー 42、6851–6857 (2001)。

記事 CAS Google Scholar

Lopez-Leon、T.、Carvalho、ELS、seijo、B.、Ortega-Vinuesa、JL & Bastos-Gonzalez、D. キトサンナノ粒子の物理化学的特性: 動電学的および安定性挙動。 J. コロイド界面科学。改訂 283、344–351 (2005)。

記事 ADS Google Scholar

Cheong, M. & Zhitomirsky, I. アルギン酸および複合フィルムの電着。コロイドサーフ。 A. 328、73–78 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

Ｒｅｄｄｙ、Ｋ．Ｍ．他 5-フルオロウラシルの制御放出のための、アルギン酸ナトリウムと N-イソプロピルアクリルアミドからなる温度感受性の半 IPN ミクロスフェア。Ｊ．Ａｐｐｌ．ポリム。科学。 107、2820–2829 (2007)。

記事 Google Scholar

リュー、A.ら。生理学的媒体から細菌を蓄積するための生体接着性表面を備えたポリピロールアクチュエータ。 ACS アプリケーション。メーター。インターフェース 1、951–955 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

カリフォルニア州ジャコバッシら。 Sense-Analyze-Respond-Actuate（SARA）パラダイム：水性媒体中の大腸菌検出のためのナノスケールからマクロスケールの作動にわたる概念実証システム。アクチュエーター 10、2 (2021)。

記事 Google Scholar

Wang、Z.ら。チタン基板上のアルギン酸塩/キトサン層ごとの複合コーティングの電着。炭水化物。ポリム。 103、38–45 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Vigués, N.、Pujol-Vila, F.、Marquez-Maqueda, A.、Muñoz-Berbel, X. & Mas, J. 細菌捕捉および一般毒性測定用の電気アドレス指定可能な導電性アルギン酸ヒドロゲル。アナル。チム。法律 1036、115–120 (2018)。

記事 Google Scholar

Chen, X.、Yan, H.、Sun, W.、Shi, Z. & Zhang, W. アルギン酸塩の電着: ミオグロビンの直接電気化学および電極触媒のための炭素イオン液体電極上の MnO2-C 複合膜。ポリム。ブル。 76、3971–3987 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Jindal, AB、Wasnik, MN & Nair, HA チオール化アルギン酸塩の合成と粘膜接着性、細胞毒性、および放出遅延特性の評価。インドの J. Pharm. 科学。 72、766–774 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

サーモサイエンティフィック。エルマン試薬 (Thermo Scientific、2011)。

Google スカラー

DC ヴァネガスら。電流測定バイオセンシングのための炭素-白金ハイブリッドナノ構造アーキテクチャの比較研究。アナリスト 139、660–667 (2014)。

記事 ADS CAS Google Scholar

サーモサイエンティフィック。架橋技術ハンドブック (Thermo Scientific、2012)。

Google スカラー

YC マルカーノおよびマサチューセッツ州サビノドラッグデリバリーシステムでの使用を拡大するための L-システインによるアルギン酸塩の化学修飾。細胞。化学。テクノロジー。 52、559–567 (2018)。

CAS Google スカラー

Srinivasan, V.、Stiefel, EI、Elsberry, A. & Walton, RA チオールおよびチオエーテル基の遷移金属イオンへの結合に関連する硫黄 2p 化学シフト。混雑する。化学。社会 101、2611–2614 (1979)。

記事 CAS Google Scholar

Moulder, JF、Stickle, WF、Sobol, PE & Bomben, KD、X 線光電子分光法のハンドブック (Perkin-Elmer Corporation、1992)。

Google スカラー

Wang, D.、Khan, W.、Tang, Z.、および Wang, Y. 白色発光ダイオードに対する固体状態の明るい緑色発光カーボンドットの適用性評価。化学。 An Asian J. 13、292–298 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

Li, Z.、Chang, SC & Williams, RS 白金および酸化白金表面上でのアルカンチオール分子の自己集合。 Langmuir 19、6744–6749 (2003)。

記事 CAS Google Scholar

サーモサイエンティフィック。 XPS硫黄。（2021年）。 https://xpssimplified.com/elements/sulphur.php。

Yang, B. & Agrios, AG チオール-カルボキシル二官能性分子 OH OH OH を使用した金属酸化物表面への Pt ナノ粒子の付着。 J. コロイド界面科学。 513、464–469 (2018)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Castner, DG、Hinds, K. & Grainger, DW X 線光電子分光法による硫黄 2p による、金表面との有機チオールおよびジスルフィド結合相互作用の研究。 J. コロイド界面科学。 7463、5083–5086 (1996)。

Google スカラー

クォン・ケイら硫黄含有規則性メソ多孔質炭素との強力な金属担体相互作用を介して、Pt ナノ粒子の電気化学的安定性と触媒活性が強化されます。カタル。今日 164、186–189 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Romanchenko, A.、Likhatski, M. & Mikhlin, Y. 水性塩化白金(IV)錯体との相互作用により硫化鉱物上に形成される生成物の X 線光電子分光法 (XPS) の研究。カタル。現在 https://doi.org/10.3390/min8120578 (2018)。

記事 Google Scholar

Yasin, HM、Denuault, G.、Pletcher, D. ヘキサクロロ白金酸浴からの白金金属の電着に関する研究。 J.エレクトロアナル。化学。 633、327–332 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

Kim、SJ、Yoon、SG、Lee、YH、Kim、SI 電気刺激によるポリ (メタクリル酸) とアルギン酸塩で構成されるヒドロゲルの曲げ挙動。ポリム。内部。 53、1456–1460 (2004)。

記事 CAS Google Scholar

Pasparakis, G. & Bouropoulos, N. アルギン酸カルシウムおよびアルギン酸カルシウム – キトサンビーズからの膨潤研究とベラパミルの in vitro 放出。内部。Ｊ．Ｐｈａｒｍ． 323、34–42 (2006)。

記事 CAS Google Scholar

Yang, J.、Chen, J.、Pan, D.、Wan, Y. & Wang, Z. キトサン誘導体とアルギン酸塩をベースにした経口薬物送達用の pH 感受性相互侵入ネットワークヒドロゲル。炭水化物。ポリム。 92、719–725 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Briandet, R.、Meylheuc, T.、Maher, C. & Bellon-Fontaine, MN Listeria monocytogenes Scott A: 異なる環境増殖条件下での細胞表面電荷、疎水性、および電子供与体および受容体の特性。応用環境。微生物。 65、5328–5333 (1999)。

記事 ADS CAS Google Scholar

マリック、L.ら。リステリアモノサイトゲネスの迅速かつ効率的な免疫磁気捕捉と放出のためのポリマーベースのマイクロ流体チップ。ラボチップ 15、3994 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

Lisdat, F. & Schäfer, D. バイオセンシングのための電気化学インピーダンス分光法の使用。アナル。バイオアナル。化学。 391、1555–1567 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

Garrote, BL、Santos, A. & Bueno, PR ラベルフリーのバイオセンシング用途における電気分光法の使用に関する展望と注意事項。 ACS Sens. 4、2216–2227 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Gaillard, J.、Berche, P. & Frehei, C. リステリア菌の細胞への侵入は、グラム陽性球菌の表面抗原を思わせる反復タンパク質であるインターナリンによって媒介されます。セル 65、1127–1141 (1991)。

記事 CAS Google Scholar

リン、Y.ら。 DNA 官能化磁性アルギン酸ナトリウムヒドロゲルと金属ポルフィリン金属有機フレームワークナノシートに基づく、トロンビン検出用の「シグナルオン」化学発光バイオセンサー。pdf タランタ 207、120300 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Zhan, X.、Hu, G.、Wagberg, T.、Zhan, S. & Xu, H. 還元酸化グラフェンとマグネタイト (Fe3O4) ナノ粒子を含むアルギン酸塩フィルムで修飾されたスクリーン印刷されたカーボン電極を使用したテトラサイクリン用電気化学アプタセンサー。マイクロチム。 Acta 183、723–729 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

Wasito, H.、Fatoni, A.、Hermawan, D. & Sutji, S. 水中の急性毒性を迅速かつ効果的にモニタリングするための生態毒性学および環境安全性固定化細菌バイオセンサー。エコトキコール。環境。サフ。 170、205–209 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Jung, I.、Seo, B.、Lee, J.、Kim, C. & Bock, M. 水毒性の検出用に、色分けされたアルギン酸マイクロビーズにカプセル化された生物発光細菌を使用するディップスティックタイプのバイオセンサー†。アナリスト 139、4696–4701 (2014)。

記事 ADS CAS Google Scholar

菊池直也ほか人間の母乳中の大腸菌を検出するためのアルギン酸塩ベースのセンサー。持続可能性 1、1–15 (2020)。

Google スカラー

リュー、R.ら。食品中のリステリア・モノサイトゲネスを迅速かつ高感度に検出するための蛍光アプタセンサーの開発。食品管理 122、107808 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Sidhu, R. et al. リステリア属菌を迅速に検出するためのインピーダンスバイオセンサーアプタマー官能化Pt櫛型微小電極アレイに基づいています。 SPIE 9863、98630 (2016)。

Google スカラー

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米国農務省国立食糧農業研究所からの資金援助、Center of Excellence として授与された賞番号 2020-67021-31375、2020-67017-33079、および 2018-67016-27578 に感謝いたします。米国科学財団 (受賞番号 CBET-1805512)。図 1 は BioRender を使用して作成されました。

テキサス A&M 大学生物農業工学部、カレッジステーション、テキサス州、77843、米国

ダニエラ・A・オリベイラ

農学、クレムソン大学、クレムソン、サウスカロライナ州、29631、米国

エリック・S・マクラモア

アイオワ州立大学機械工学部、エイムズ、アイオワ州、50011、米国

カルメン・L・ゴメス

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この原稿は著者全員の寄稿によって書かれました。すべての著者が原稿の最終版に承認を与えました。概念化、ESM、CLG。方法論、DAO、ESM、CLG。検証、DAO、CLG; 形式分析、DAO、ESM、および CLG。リソース、ESM および CLG。データキュレーション、DAO、ESM、CLG。執筆-原案作成、DAO。執筆、レビュー、編集、DAO、ESM、および CLG。視覚化、DAO、ESM、CLG。監督、ESMおよびCLG。資金調達、ESM、CLG

カルメン・L・ゴメスへの通信。

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転載と許可

Oliveira, DA、McLamore, ES & Gomes, CL 刺激応答性アルギン酸白金チオメルナノブラシに基づく、ラベルフリーのリステリアモノサイトゲネスの迅速な検出。 Sci Rep 12、21413 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-25753-7

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受信日: 2022 年 5 月 13 日

受理日: 2022 年 12 月 5 日

公開日: 2022 年 12 月 10 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25753-7

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