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Nature Communications volume 13、記事番号: 3286 (2022) この記事を引用

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169 オルトメトリック

メトリクスの詳細

神経回路の理解を進める上で中心となるのは、神経活動の記録と調節を同時に行える低侵襲性のマルチモーダルインターフェースを開発することです。 最近のデバイスは、炎症反応を軽減するために組織の機械的コンプライアンスを適合させることに重点を置いています。 ただし、生体適合性と長期記録機能をさらに向上させるには、マルチモーダル インターフェイスのサイズを縮小する必要があります。 ここでは、ニューラルネットワークの効率的な電気的および光学的調査を可能にする、侵襲性を最小限に抑えた設置面積 (ミリメートル長で直径 8 ～ 14 μm) を備えたマルチモーダル同軸マイクロプローブの設計を紹介します。 脳内では、プローブにより堅牢な電気測定と光遺伝学的刺激が可能になりました。 スケーラブルな製造戦略をさまざまな電気材料および光学材料で使用できるため、長さ、直径、機械的特性などの実験要件に合わせてプローブを高度にカスタマイズできます。 炎症反応が無視できることを考えると、これらのプローブは、長期的かつ低侵襲性で神経回路とインターフェースするための、容易に調整可能な新世代のマルチモーダルデバイスを可能にすることが期待されます。

微小電極記録は、あらゆる神経系領域において個々のニューロンの活動を高い時間分解能で測定するためのゴールドスタンダードであり、行動の制御における神経回路の役割を定義する上で中心となります。 ユタ アレイやミシガン アレイなどの微小電極アレイにより、分散した神経活動をミリ秒の精度で追跡できるようになりました 1,2。 ただし、その設置面積と剛性が大きいため、組織の損傷や炎症が発生し、長期の記録が妨げられます 3,4。 最先端の Neuropixel プローブとカーボンファイバープローブは、電極密度を高め、プローブの寸法と剛性を低減することにより、これらの以前のデバイスを改良しています5、6、7。 これらのプローブは神経インターフェースの分野を進歩させましたが、次世代デバイスでは、共局在化された電気記録に加えて、標的を絞った刺激が可能になるはずです 3,8。 光遺伝学的技術は、光感受性オプシンの標的発現と活性化を通じて細胞活動の高速調節を可能にします9。 しかし、神経組織の強い光散乱と高い吸収特性を考慮すると、深部神経回路との光遺伝学的インターフェースには通常、大径の硬質ファイバーの移植が必要であり、このアプローチは電気的な対応物よりも侵襲性が高くなる可能性があります10、11、12。

理想的な神経プローブは、小さな断面寸法と調整可能な長さを維持しながら、光学モードと電気モードを組み合わせるものです。 遺伝的に定義されたニューロンの種類および回路と双方向に接続できる能力は、神経系がどのように動作を計算し制御するかを最終的に理解できるようにするための鍵となります。 また、感覚運動障害のメカニズムの基礎を決定し、回路活動が傷害によってどのように影響を受けるか、またそれがどのように回復または促進されるかを定義するための基礎でもあります。 光モダリティと電気モダリティを統合するアプローチは、既存のユタアレイへの光ファイバーの追加から、オプテトロードまたはその他の統合された電気光学同軸構造まで多岐にわたります13、14、15、16、17。 これらの技術は、生体内での電気的記録と光刺激の同時実行に大きな期待を寄せています。 ただし、長期間の記録では免疫反応を最小限に抑えるためにデバイスの設置面積を削減する必要性は依然として存在します3、18、19、20、21。

この研究では、私たちの知る限り、小さな中央の光ファイバーコアを取り囲む低インピーダンス電気チャネルを備えた最小のマルチモーダル同軸神経プローブを紹介します。 これらの電気光学機械的フレキシブル (EO-Flex) プローブは、マイクロファイバー光導波路コアを使用するか、ナノファイバー光コアを使用する場合はさらに小さな直径を使用して、最小 8 μm の直径と最大数ミリメートルの長さで製造できます。 また、シングルモード ファイバー (SMF) に直接結合して、標準的な光遺伝学的ハードウェアに直接接続できる取り外し可能な低損失の光インターフェイスを作成することもできます。 EO-Flex プローブの電気的記録と光刺激の同時性能は、マウスの脳で実証されています。 私たちの実験では、多孔質金属電気チャネルが、プローブのサイズが小さくても優れた記録能力を提供することを示しています。 ソースからチップまでの光損失が 10 dB 未満と低いため、標的細胞でオプシンを発現するトランスジェニックまたはウイルス形質導入マウスにおいて強力な光遺伝学的刺激が可能になります。 インプラント研究では最小限の免疫反応が示されており、完全にカスタマイズ可能なプローブと将来の高密度アレイにより、周囲の神経組織への妨害を最小限に抑えながら長期的なインターフェースが可能になることが示唆されています。

EO-Flex プローブは、マイクロファイバーおよびナノファイバーの光学コアを使用して製造されました (「方法」を参照)。 ここでは、直径12μm未満を維持しながら3mmを超える長さのプローブを可能にするコアとして、量産可能なシリカマイクロファイバーに焦点を当てます（図S16a）。 ただし、製造プロトコルは一般的であり、サブ波長の金属酸化物ナノファイバー導波路などの他の光コアとともに使用して、超小型プローブを製造できます（図S3）。 光遺伝学ハードウェアへの効率的な結合を可能にするために、まずマイクロファイバーをシリコン基板上に配置し、ファイバーの一端が基板の端から突き出るようにしてから、劈開したSMFにバットカップリングしました（図1a）。 アクティブアライメントを使用して、マイクロファイバーとSMFの間のモードの重複を最大化しました。 カップリングは、SMF の端に UV 硬化型光学接着剤の液滴を使用して固定されました (図 1b)。

a 所定の長さのシリカ マイクロファイバーがシリコン基板上に配置され、シングルモード ファイバー (SMF) を搭載したフェルールがマイクロファイバーに接着できるようになります。 b (上から下) 写真は、マイクロファイバーを SMF に結合するアクティブな位置合わせと結合プロセスを示しています。 c 酸化イリジウム (IrOx) のスパッタリング後にポリ (3,4-エチレンジオキシチオフェン) ポリスチレンスルホン酸 (PEDOT:PSS) を堆積するための電着セットアップの概略図。 d 光がミラーで反射するときの側面からのプローブの光出力と、レーザー光を使用した場合と使用しない場合の劈開端面からの光出力の光学画像（拡大挿入図）。 (挿入図) プローブを色素溶液に浸し、青色 (442 nm) の光をプローブに入射した後のプローブの円錐角をキャプチャした蛍光画像。 顕微鏡写真はいくつかの実験を通じて作成されました。 e 端をフライス加工した後の EO-Flex プローブの断面電子顕微鏡写真。光学ガラス (SiOx) コアとともに露出した導電性リングが示されています。 同様の特性が得られた同様のプローブについて複数の電子顕微鏡写真が記録されました。 f PEDOT:PSS クラッドあり (黒線) およびなし (緑線) のフライス加工プローブの EIS データ。 平均インピーダンスは、n = 4 個のプローブの 1 つの標準偏差を表す薄い影の領域で表示されます。 g さまざまなクラッド層を示すプローブの断面図。 h マイクロファイバー先端領域を拡大した、完成した EO-Flex プローブの写真。 スケーリング戦略については、図S16を参照してください。

in vivo テスト用の堅牢な取り外し可能なインターフェイスを作成するために、SMF はセラミック製フェルールに挿入されました。 フェルール アセンブリの遠位端は、パッチ ケーブルに接続できるように機械研磨されました (図 1g、h)。 さまざまなアプリケーション向けの他のインターフェイス設計も考えられます (図 S16)。 プローブ先端の周囲に低ノイズの導電層を形成するために、379 ± 43 nm の酸化イリジウム (IrOx) 層をマイクロファイバー上にスパッタリングし、続いて 362 ± 137 nm のポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン) ポリスチレンの電気化学的に堆積させた層を形成しました。スルホン酸塩 (PEDOT:PSS) (図 1c)22. IrOx の多孔質の性質により、導電性 PEDOT:PSS 層の密着性が向上し、プローブの全体的な電気的性能が向上します。 プローブを電気的に絶縁し、生体適合性表面を提供するために、プローブは 1.76 ± 0.16 μm のパリレン C で不動態化されました (図 S2)。 電気表面と光学表面を露出させるために、集束イオン ビームを使用してチップを劈開しました (図 1e、サポート情報を参照)。 図 1g は最終的なプローブ設計を示し、図 1h は完成したプローブの写真を示します。 IrOx と PEDOT:PSS の組み合わせにより、15 μm2 未満の電極面積から 1 kHz で 1 MΩ 未満の電気インピーダンスが達成されました (図 1f)。

プローブの光学特性は、色素溶液中の出力コーン角をイメージングすることによって最初に評価されました（図1d、挿入図）。発散角は10〜15°でした。 重要なのは、クラッド層をプローブ上に配置した後、クラッド前のプローブ（図1b）と比較して、マイクロファイバー/SMF界面（図1d）からは検出可能な散乱光が観察されないことです。 レーザー結合パッチ ケーブルと EO-Flex 出力間の光損失は、3 つの異なる波長 (473、543、600 nm) を使用して定量化され、すべてのデバイスで < 7 dB を示しました (n = 4)。 これらの値は、フェルール スリーブの最大 2 µm のモード位置ずれのシミュレーション結果とよく一致します (図 S1)。 電気化学インピーダンス分光法 (EIS) は、1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に浸した状態でプローブに対して実行されました。 製造およびテストされたすべてのプローブは、PEDOT堆積前の>10 MΩと比較して、クラッド堆積および先端のフライス加工後は1 kHzで844 ± 179 kΩ（n = 4、図1fおよび図S2a〜d）の平均電気インピーダンスを示しました。

EO-Flex プローブが in vivo での高感度電気測定を可能にすることを確認するために、イソフルラン麻酔したマウスの皮質で蛍光標識細胞を用いて細胞外記録と 2 光子イメージングを同時に実行しました (サポート情報を参照) 23,24。 このアプローチにより、組織内でのプローブの挿入と目標とする動きのモニタリングが可能になりました（図 2a）。 水浸漬を使用すると、プローブは最小限の座屈で露出した硬膜を容易に貫通し（ビデオS1）、光学的にアクセス可能な皮質層2/3の標的領域に到達しました（図S12およびビデオS2）。 3 軸マイクロマニピュレーターに取り付けた場合、組織内に入るとプローブ先端の横方向の位置を微調整して、信号対雑音比を最適化し、個々のニューロンを標的にすることが可能でした。 ただし、横方向の動きは通常 30 μm 未満に制限されていました。 このアプローチを使用して、内因性のマルチユニットおよびシングルユニット活性を取得しました（図2b）。 主成分分析（PCA）と電気的記録のガウスクラスタリングを使用して、個別のユニットの数を決定しました（図2c）。 スパイク率は、記録の全期間に適用されたベイジアン適応カーネル スムーサー (BAKS) アルゴリズムを使用して計算されました (図 2d)。 図 2b ～ e は、代表的な記録を示しています。 長さ約 1 mm の EO-Flex プローブを使用して、プローブの最大長までの皮質深部領域からの電気記録も取得しました。 これらの記録の電気的特徴は、すべての皮質層にアクセスできることを示唆しています（図S4）。

a 視覚的にガイドされた電気測定に使用されるセットアップを示す回路図。 蛍光標識細胞に関連したプローブの 2 光子イメージング (「方法」を参照) を使用して、組織内のプローブの動きを追跡し、記録位置を最適化しました。 (挿入図) 画像化と電気的記録を同時に行うための手術準備の拡大断面図。 b イソフルラン麻酔マウスの皮質層 2/3 (深さ = 250 μm) における自発的神経活動を示す EO-Flex 記録の例。 スパイクを定義するしきい値 (赤い線) は \({{{{{\rm{Threshold}}}}}}=4* {{{{{\rm{median}}}}}}\left( \frac{\left|{{{{{\rm{録音}}}}}}\right|}{0.675}\right)\) 公開文献に基づく36。 (四角で囲まれた領域) 記録からの 1 秒の抜粋は、複数のユニットのアクティビティを示しています。 c 確立されたクラスタリング手法を使用した波形クラスタリングの主成分 (PC) 分析プロット37。 d (b) に示す 1 分間の記録にわたるスパイク率は、ベイジアン カーネル推定を使用して計算されました。 e (b) の記録から PCA によって決定された 4 つのクラスターの平均波形 (実線) と 1 つの標準偏差 (斜線領域)。

次に、末梢で誘発された活動を記録する EO-Flex プローブの能力を実証するために、体の反対側のひげから感覚入力を受け取るバレル皮質にプローブを挿入しました。 プローブを脳内に進める間、動物がまだイソフルラン麻酔下にある間、エアパフを使用して定期的にひげをそらしました。 相関する活性が観察されたら、プローブの位置 (約 900 μm 挿入) を所定の位置に固定し、麻酔を止めました。 測定は、動物が歩き始めてから 30 ～ 60 分後に開始しました。 ビデオ録画を使用して、エアパフを介したウィスカーの偏向を検証し、赤外線照明下での自発的なウィスカー挙動を記録しました（図3a〜c）。 さらに、マウスの運動活動は、動物を配置した球形トレッドミルに取り付けられた光学エンコーダーを使用して記録されました。 さまざまなパルス周波数（2、3、および5 Hz）と幅（20および50ミリ秒）を使用してひげを偏向させた（図3f〜q）。これにより、刺激に依存してスパイク率が増加し、これは休息中に最も顕著でした。 （つまり、自発的な泡立てがない場合）。 バレル皮質におけるプローブの位置をさらに裏付けるために、EO-Flexプローブを介した電気刺激（100 Hzで0〜300μAの二相パルス）を実施し、その結果、電流振幅に依存するウィスカーの偏向が生じました（図S5）。

実験セットアップの概略図。 ウィスカは、関数発生器で制御された圧力システム (Picospritzer) に接続されたマイクロピペットを通じて送達されるエア パフ刺激によってそらされました。 ファンクション ジェネレーターは、アナログ データとビデオ データの同期のために赤外線 LED も制御しました。 b ひげが曲がる前の休息中の動物を示すビデオ フレーム。 青い矢印はウィスカーの例を示します。 赤い丸は赤外線 LED の位置を示します。 c エアパフ送達中の表示されたウィスカーのたわみを示すビデオ フレーム。 d 3 Hz のひげ刺激 (黄色) 中の EO-Flex 記録 (黒色) の例。 e 対応するスパイクのソートされた平均波形。1 つの標準偏差が影付きで表示されます。 異なる神経波形は異なる色でマークされます。 f – h 2 Hzの刺激周波数（パルス幅50 msのパルス幅）（f）、刺激周囲時間ヒストグラム（g）、および発火周波数のBAKS推定（h）のひげ刺激誘発活動を示すラスタープロット。 i – k ラスタープロット (i)、刺激周囲時間ヒストグラム (j)、および 3 Hz 刺激 (50 ms パルス幅) の BAKS 推定。 l–n 5 Hz 刺激（50 ms パルス幅）のラスター プロット（l）、刺激周囲時間ヒストグラム（m）、および BAKS 推定（n）。 o – q 3 Hz 刺激（パルス幅 20 ms ）のラスター プロット（o）、刺激周囲時間ヒストグラム（p）、および BAKS 推定（q）。 パネル (a) は Biorender.com で作成されました。

同じプローブで電気的に記録しながら同時に神経活動を光学的に誘発する EO-Flex プローブの能力を実証するために、ニューロンにおける青色光活性化イオンチャネル チャネルロドプシン 2 (ChR2) の発現を伴う実験を麻酔下の Thy1-ChR2-YFP マウスで実施しました。 。 視覚的な制御下でプローブを皮質層 2/3 に挿入しました。 ChR2の励起に適した473 nmダイオード励起固体（DPSS）レーザーがプローブに結合され、刺激パラメーターが体系的にスイープされました（図S6、S8、S9）。 刺激周波数 (10 ～ 50 Hz)、パルス幅 (0.6 ～ 9.8 ms)、および出力 (5 ～ 208 μW) を変更して、ChR2 発現ニューロンを興奮させる最適な設定を決定しました。 同時に記録された電気活動の波形解析を使用して、光パルス列と同期して細胞を発火するには、最小電力29μW（2849mW mm-2）が必要であることがわかりました（図S6）。 図4a〜bに示す記録例では、PCAをデータのクラスタリング用の混合ガウスフィットと組み合わせて、刺激期間中に発生する2つの異なる波形（図4d）を持つ2つの一次クラスタ（図4c）を生成しました（図4d）。 .4e–g)。 同様の最大光パワーと刺激周波数で非トランスジェニック動物でEO-Flexデバイスをテストすることによって実証されたように、近位光チャネルと電気チャネル間の干渉（例、ベクレル効果）が最小限であることがわかりました（図S10）。 ベクレル効果が存在しないことは、同じ光遺伝学パルス列を使用して同様のレーザー出力 (208 μW) で光ポンピングしながら、EO-Flex プローブを ChR2 発現ニューロンから遠ざけるか、緩衝液に置くことによって、さらに検証されました。 (図S11)。 この最大出力では、神経回路は最小限の時間遅れで応答し（図S6f）、同期発火を維持するのに苦労する前に最大40 Hzの周波数刺激に従うことができました（図S9）。

a 1 Hzでオンとオフを繰り返す61 μWのチップパワーで473 nmの光（パルス幅4.95 ms）の20 Hzパルス列（青いバー）を使用して、光学的に誘発された神経活動。 閾値ライン（赤）は、図 2 で定義されているように設定されました 36。 b (a) の記録のスパイク レート プロット。 c 光によって誘発された神経活動の主成分 (PC) プロット。 個別のクラスターは異なる色で表示されます。 d (c) の各クラスターの平均波形 (緑または黒の実線) と 1 つの標準偏差 (影付き領域)。 e 各クラスター (色調整された黒または緑) は、単一パルスのウィンドウ (青いバー) とともに時間の経過とともにプロットされます。 f 各刺激期間のスパイク率のベイジアン カーネル平滑化推定。 g (d) の波形の発生を示す色付きラスター プロット。 h 単一パルス サイクルの 1 秒間の計算された平均スパイク レート。

神経活動を光学的に誘発する EO-Flex プローブの能力は、AAV2-CaMKII-C1V1-mCherry ベクターを注射した Vglut2-GCaMP6f マウスにおける二光子カルシウムイメージングによってさらに検証されました (方法を参照)。 皮質注射の 4 ～ 5 週間後、緑色光で活性化されるオプシン C1V1 を発現する第 2/3 層領域に EO-Flex プローブを挿入しました。 556 nm DPSS レーザーを EO-Flex プローブに結合し、同時に神経細胞のカルシウム過渡状態をモニタリングしながら刺激パラメーターをスイープしました。 送達された光パルスは、視野内のC1V1陽性ニューロンにおける相関したカルシウムスパイクを引き起こしました（図S12）。 神経活動の光誘発の成功は、同時電気記録によっても検証されました（図S12e）。 総合すると、我々の生体内データは、EO-Flex プローブが無傷の脳の神経活動を電気的に記録し、光学的に調節する能力を実証しています。

EO-Flex プローブを使用すると、10 ～ 50 Hz の範囲の発火速度でオプシン発現細胞の標的化と同調が可能になります (図 S9)。 ニューロンを確実に活性化するための最小出力 (29 µW) は、以前のレポート (1 ～ 10 mW mm-2) よりも高い 15,26,27 ですが、EO-Flex プローブの光学コアが小さいため、次の点に注意する必要があります ( 3.6 μm）、組織からの光の吸収と散乱が予想されるため、より高い強度により、従来のより大きなコアの光ファイバーと比較して、ニューロンをうまく動員するのに十分な大きさと強度の照明ボリュームが生成されることが期待されます。 図S6bのモンテカルロシミュレーションは、29μWの刺激パワーで、光パワー密度が先端から約1.2mmのところで光遺伝学的閾値1mW mm-2を下回ることを示しています。 光遺伝学的実験で利用した最大刺激出力（プローブ先端で208μWまたは20,435mW mm-2）でも、細胞への悪影響（たとえば、発火速度またはカルシウムレベルの持続的な変化）は観察されませんでした（図S10） –12)。 最近の研究では、出力 <0.25 mW での連続光曝露では、神経活動に対する温度の影響 (つまり、刺激期間中の電気信号の劣化) が生じないことが示唆されています 28。 神経組織に対する光加熱の影響を最小限に抑えるために、短いパルス幅と250μW未満の光出力を利用しました（図S6〜10）。 これらの照明パラメータを使用すると、最小限の加熱効果が期待されます。これは、以前に検証された加熱モデルを EO-Flex プローブに適用することで検証されました (図 S7b)29。

次に、プローブの埋め込みに対する脳の反応を評価しました。 EO-Flex プローブを、標識ミクログリアを有するヘテロ接合 Cx3cr1-GFP マウスの皮質に 6 日間および 30 日間移植しました。 光遺伝学実験で一般的に使用される直径 250 μm のマルチモード ファイバーを、同じ定位座標を使用して、比較のために反対側の半球に挿入しました。 両方の移植部位を含む連続脳切片を調製した。 組織切片を抗GFAPおよび抗NeuN抗体で共染色し、反応性星状神経膠症および神経細胞喪失をそれぞれ定量しました（n = 4マウス、マウスあたりN = 8切片）（図5および図S14、15）。 移植後6日目に、マルチモードファイバーが重大なニューロンの喪失、ミクログリア数の2.08±0.23倍の増加、およびGFAPレベルの2.68±0.60倍の増加を引き起こしたことを発見しました（図5e-g）。 対照的に、EO-Flexプローブは、挿入部位周囲のNeuN陽性細胞の有意な減少やミクログリア数またはGFAPレベルの増加を示さなかった（図5e-g）。 移植後30日目に、移植されたコントロールマルチモードファイバーでニューロンの喪失が再び観察され、ミクログリア数の2.33±0.27倍の増加、およびGFAPレベルの2.81±0.63倍の増加が観察されました（図5l-n）。 。 対照的に、EO-FlexプローブはNeuN陽性細胞の有意な減少やGFAPレベルの増加を示さなかったが、ミクログリア数のわずかな増加を示した（図5l-n）。 これらの結果は、埋め込み期間中の EO-Flex プローブの挿入または移動に対する組織反応は、炎症反応が通常最も顕著である時点では無視できる程度であり、光遺伝学実験に使用される標準プローブと比較してかなり小さいことを示しています 30。 最後に、この最小限の免疫反応を考慮して、EO-Flex プローブ移植後最大 30 日間の慢性的な記録も実行しました。 これらの記録により、調査したすべての時点（0、1、2、6、および30日目）にわたって優れた信号対雑音比が明らかになりました（図S13）。

a、b マルチモードファイバー（a）および EO-Flex プローブ（b）移植部位周囲の厚さ 20 μm の冠状脳切片を示す光学画像。 マルチモードファイバー (直径、250 μm) と EO-Flex プローブ (直径、12 μm) の両方を皮質の深さ約 1 mm まで進めました。 画像は、標識ミクログリア (緑色) をヘテロ接合 Cx3cr1-GFP マウスに移植してから 6 日後に撮影されました。 切片を抗 NeuN (青) および抗 GFAP (マゼンタ) 抗体で共染色し、それぞれニューロンと星状膠細胞を標識しました。 c、d (a、b) のプローブ先端が位置する領域を拡大した高解像度画像。 e – g ニューロン細胞数（e）、GFAP発現レベルによって測定されるアストロサイト反応性（f）、およびミクログリア反応性に対するマルチモードファイバーまたはEO-Flexプローブ移植の影響を示す集団分析（2匹の動物からのn = 16セクション） 6日間の移植におけるミクログリア細胞数(g)によって測定される。 細胞応答を定量化し、各挿入部位に隣接する 2 つの 150 µm × 1 mm 分析領域にわたって平均しました。 手術とプローブ関連の組織反応を区別するために、各デバイスの埋め込み部位の 0.7 mm 外側に同等のサイズの追加の開頭術が行われました。 同じ分析アプローチを使用して、この偽手術部位での細胞反応を定量化しました。 両側対応のある t 検定により P 値を決定しました。 h、i マルチモードファイバー (h) および EO-Flex プローブ (i) の移植から 30 日後に撮影された冠状脳断面の光学画像。 j、k プローブ先端が位置する (h) および (i) の領域を拡大した高解像度画像。 l – n 30日間の移植における神経細胞数（l）、アストロサイト反応性（m）、およびミクログリア反応性（n）を示す、対応する集団分析（2匹の動物からのn = 16切片）。 両側対応のある t 検定により P 値を決定しました。 P 値を示すために次の規則が使用されました。「ns」は P > 0.05 を示し、「*」は 0.01 < P ≤ 0.05 を示し、「**」は 0.001 < P ≤ 0.01 を示し、「***」は 0.0001 < P ≤ を示します。 0.001。 すべての棒プロットは平均値 ± 標準誤差として表示されます。

要約すると、我々はマルチモーダル同軸マイクロプローブの作製について報告し、2つのモダリティ間の干渉を最小限に抑えながら固有の神経回路を光学的に刺激し、電気的に記録する能力を実証します。 EO-Flex プローブは設置面積が小さく、アスペクト比が高いため、侵襲性を最小限に抑えて神経回路と接続できます。 より小さな光ファイバーコアを使用するこの同軸設計により、さらなるサイズの縮小が可能です。 ただし、そのトレードオフとして、光損失と電気インピーダンスが増加します（図S3）。 プローブの機能は脳内でのみテストされましたが、プローブの直径と長さの優れた制御を備えたプラットフォームとして、さまざまな化学組成を備えたクラッド材料の選択、固有の機械的柔軟性、およびプローブ密度をスケールアップするための明確なルート（たとえば、クラッディングの堆積プロセスを繊維束に変換する）（図S16c）、この技術は、脊髄や末梢神経を含むさまざまな神経系領域の低侵襲インターフェースとしてすぐに応用できるはずです。

事実上あらゆる長さのマイクロファイバーを生成できるため、開発された製造プロトコルを使用すると、さらに深い脳領域に到達できるプローブの開発が簡単になります（図S16a）。 ただし、所定のクラッド層のセットでは、プローブの剛性は長さに応じて減少します。 したがって、プローブが長い場合は、挿入プロセス中の低い座屈力を克服するための追加の戦術が必要になる可能性があります（たとえば、溶解可能な糖衣または硬質ポリマー層）31。 あるいは、硬膜の外科的切開によってプローブの挿入が容易になる場合もあります。 プローブの長さに関係なく、当社の移植研究では、設置面積の小さい EO-Flex プローブは、標準的なマルチモード ファイバーと比較して免疫応答が大幅に低下していることが実証されました。

500 μm から 1 cm の間で長さが異なるシリカ マイクロファイバー (コア直径と総直径: それぞれ 3.63 ± 0.31 μm と 5.60 ± 0.42 μm) が、リーチした光ファイバー束から生成されました (Schott、部品番号 1573179)。 劈開後、個々のファイバーがシリコン基板上に分散されました。 3 軸マイクロマニピュレーターに取り付けられたタングステン針を使用して、ファイバーの一端がエッジから > 100 μm 浮いた状態でマイクロファイバーを基板エッジ近くに配置しました。

導波路と標準的な光遺伝学的ハードウェアとの効率的な光結合を可能にするために、マイクロファイバーコアよりわずかに小さいモードフィールド直径（2.8～3.4μm）のシングルモードファイバー（SMF）（Thorlabs S405-XP）が選択されました。 in vivo テスト用の堅牢な取り外し可能なインターフェイスを作成するために、SMF をセラミックフェルール (Thorlabs CF126-10) に挿入し、急速硬化エポキシ (DevCon #20445) で所定の位置に固定しました。 次に、ファイバ検査スコープ（Thorlabs、FS200）を通して滑らかな結合界面が観察されるまでフェルールアセンブリを機械研磨し、ルビースクライブ（Thorlabs S90R）を使用して反対側のファイバ端（導波路への結合用）を劈開しました。 フェルール アセンブリを 3 軸ステージに取り付け、スクライブした端を、端に小さな液滴が形成されるまで UV 硬化光学接着剤 (Norland Optical Adhesive 81) の液滴内に移動させました。 SMF とマイクロ/ナノファイバー間の効率的な結合は、544 nm He-Ne レーザー光源を光学顕微鏡に結合した後、0.4 NA 20x 対物レンズを備えた正立光学顕微鏡 (Nikon、ソフトウェア: Amscope v3.7.9229.20170607) の下でアクティブ アライメントを使用して達成されました。 SMF。 SMF を平行移動させて導波路へのパワー結合を最大化した後、液滴の周囲でビームを連続的に移動させながら、UV 光 (HeCd レーザーからの 325 nm 線) に 30 秒間曝露して、NOA 81 接着剤を固定しました。

金属層を堆積する前に、光がアセンブリに結合されるフェルールの底部をマスクするために、プローブ アセンブリをカスタムのアルミニウム ブロック ホルダーに配置しました。 これにより、メタライゼーション中に光結合界面が確実にマスクされるようになりました。 このブロックは、スパッタリング チャンバー (Denton Discovery 18) 内の回転プレート上に配置されました。 チタンの薄い（<10 nm）接着層（2.5 mTorr、5 秒、200 W）が堆積され、続いて酸化イリジウム（IrOx）の厚さ 300 nm の層（12 mTorr、15 分、100 W、5 sccm O2）が堆積されました。流量) または 500 nm の白金 (Pt) (2.5 mTorr、20 分、200 W)。 酸化イリジウムは、従来の白金層と比較して約 3 倍高い電荷注入能力と、金属層の電気化学的表面積を増加させる多孔質の性質により選ばれました 32。

これらの手順を組み合わせることで、生体内イメージングおよび光遺伝学セットアップに再現可能に取り付けるためのフェルール アセンブリが得られました (図 2)。 代替のインターフェース設計（例えば、プローブアレイ用）を図S16に示します。

プローブの電気インピーダンスをさらに下げるために、ポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)-ポリスチレンスルホン酸 (PEDOT:PSS) 層が IrOx 上に堆積されました。 プローブを、2.5 mg/mL のポリ(スチレンスルホン酸ナトリウム) (PSS; Millipore-Sigma) を含む EDOT (97%、Millipore-Sigma) の 0.01 M 溶液に浸しました (プローブ先端の約 100 μm)。 電気化学堆積は、200 nA の電流で 5 分間動作するように設定された定電流モードで動作する電気化学ポテンショスタット (VersaSTAT4) に接続された白金ワイヤ対電極と Ag/AgCl 参照電極 (CHI 111 P、CH Instruments) を使用して実行されました。 –30秒これにより、厚さ362±137nmのポリマー層が得られました（図1eおよび図S2）。 次に、PEDOT-IrOx (または PEDOT-Pt) でコーティングされたマイクロファイバーを、化学蒸着 (SCS Labcoater Deposition System、Specialty Coating Systems) を使用して 1.5 ～ 2 μm のパリレン C で不動態化しました。

30 kV で 5 nA に設定された集束イオン ビーム (FEI Scios デュアルビーム) を使用してプローブの端を切断し、電気チャネルと光チャネルを露出させ、マイクロファイバー コアの最終的なプローブ直径が 8 ～ 12 μm であることが明らかになりました。 。 電気化学インピーダンス分光法 (EIS) を Versastat4 (VersaStudio v.2.60.6 を実行) で実行し、上記と同じ参照電極と対電極を使用して 1 × リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中のプローブ インピーダンスを測定しました。 光結合効率は、ケーブルに交換可能に結合された 3 つの光源 (473、543、および 673 nm) を使用して、光ファイバーパッチケーブル (Thorlabs、P1405B-FC-5) からの光出力を測定することによって決定されました。 光パワーは、フェルールをデジタルパワーメータ (Thorlabs、PM100D) の検出器ヘッドから 5 ～ 10 mm 離して配置して測定しました。 次に、セラミック製フェルール スリーブ (Thorlabs、ADAL1) をパッチ ケーブルの途中までスライドさせ、反対側の端にさまざまな EO-Flex プローブをスライドさせて、光を結合させました。 EO-Flex プローブの先端からの光パワーは、パッチ ケーブルと同様のプロトコルを使用して測定されました。

すべての生きた動物の手順は国立衛生研究所 (NIH) のガイドラインに従って実行され、プロトコル番号 13-00022 に基づいてソーク研究所の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されました。 光遺伝学的実験と電気生理学的実験を組み合わせたために、Thy1-ChR2-YFP 雄マウス (在庫番号 007612; Jackson Laboratories; 月齢: 10 か月) を使用しました。 カルシウムイメージング、光遺伝学、および電気生理学的実験を組み合わせた場合、AAV2-CaMKII-C1V1-mCherryを注射したVglut2-GCaMP6f雄マウス（Vglut2-CreノックインマウスとAi95Dマウスの間のカスタム交雑；それぞれストック#028863および#024105）を使用しました。 ; ジャクソン研究所; 年齢: 3 か月); 免疫応答およびその他すべての研究には、ヘテロ接合 Cx3cr1-GFP 雄マウス (在庫番号 005582; Jackson Laboratories; 年齢: 9 週齢) を使用しました。

外科的処置は、以前に確立されたプロトコールに厳密に従って行われた 33,34。 簡単に説明すると、薄肉ガラス ピペットを Sutter Flaming/Brown マイクロピペット プラー (モデル P-97) で引っ張りました。 ピペットチップは、滅菌技術を使用して 10 倍の倍率で鋭角に切断されました。 先端の直径は通常 15 ～ 20 μm でした。 鋭利なベベルを生じず、先端の直径も大きくなかったピペットは廃棄した。 脳に注入されたウイルスの量を測定するために、抜かれた各針にミリメートルの目盛りが付けられました。

マウスをイソフルラン（導入用に4％、維持用に1〜1.5％）で麻酔し、デジタル座標読み取りとアトラスターゲティングを備えたコンピューター支援定位システムに配置しました（Angle Two、Leica）。 体温はDC温度コントローラーで36〜37℃に維持し、目の乾燥を防ぐために眼科用軟膏を使用しました。 少量の脱毛クリーム (Nair) を使用して、指定された皮膚切開部位の脱毛を行いました。 皮膚を洗浄し、ベタジンと 70% エタノールの 2 段階スクラブで滅菌しました。 正中線切開を目の直後から開始し、ラムダ縫合糸を通過したところで終了した。 頭皮を引っ張って開き、メスと鉗子を使用して骨膜を洗浄して、デジタルアトラスの校正と座標マーキングのために目的の半球を露出させました。 ピペットチップを使用して基準点 (ブレグマとラムダ) を配置し、プログラムに入力したら、デジタル アトラス上で目的のターゲットを設定します。 注入ピペットを標的部位まで注意深く移動させた(座標: AP -1.5 mm、ML 1.5 mm)。 次に、開頭部位にマークを付け、溝付きビット (先端直径 0.5 mm) を備えた電気マイクロドリルを使用して、標的注射部位上の骨の直径 0.5 ～ 1 mm 部分を薄くしました。 骨が軽く曲がるほど十分に薄くなったら、付属の注射器を備えた滅菌 30 G 針を使用して、骨の小さな部分 (0.3 ～ 0.4 mm) を慎重に切断し、持ち上げます。

注射の場合、ウイルスを 1 滴注意深くパラフィルム上にピペッティングし (1 ～ 2 μl)、引き抜かれた注射針を所望の量で満たします。 十分な量を注入したら、目標の深さ (DV 0.2 mm) に達するまで、注射針をゆっくりと脳内に下げました。 収縮チューブで接続された 30 mL シリンジを使用して手動圧力を加え、0.4 μl の AAV2-CaMKII-C1V1-mCherry ベクター (6.1E + 12 VP/mL; 未希釈; UNC Vector Core) を 5 ～ 10 時間かけてゆっくりと注入しました。分。 ウイルスが注射されると、注射器の圧力バルブがロックされました。 ウイルスを拡散させ、針を引っ込める際の逆流を避けるために、この位置を約 10 分間維持しました。 注射後、皮膚を切開部に沿って縫合した。 マウスにBuprenex SR（1kg当たり0.5mg）を皮下投与し、ホームケージに入れる前に回復させた。 ベクターは、in vivo 記録前に 4 ～ 5 週間発現させました。

外科的処置は確立されたプロトコルに厳密に従って行われました 23,35。 簡単に説明すると、マウスをイソフルランで麻酔し（導入には 4 ～ 5%、維持には 1 ～ 1.5%）、特注の手術用ベッド（Thorlabs）にヘッド プレートを移植しました。 体温は DC 温度制御システムで 36 ～ 37 °C に維持され、目の乾燥を防ぐために眼科用軟膏が使用されました。 脱毛クリーム（Nair）を使用して、指定された皮膚切開部位の毛を除去しました。 ベタジンと 70% エタノールの 2 段階スクラブで皮膚を徹底的に洗浄し、消毒しました。 頭皮部分を外科的に除去して、前頭部、頭頂部、および頭頂間頭蓋骨部分を露出させた。 組織適合性接着剤（Vetbond; 3M）を使用して、頭皮の端を頭蓋骨の側面に取り付けました。 特注で機械加工された金属プレートが歯科用セメント (カタログ番号 H00335; Coltene Whaledent) で頭蓋骨に固定され、特注のホルダーで頭部を安定させることができました。 マウスには、麻酔が解除される前にブプレネックス SR (0.5 mg/kg) が与えられ、さらなる準備の前に少なくとも 3 日間回復させられました。

イメージングと電気生理学的記録を組み合わせて、ターゲット領域 (AAV ベクター注射部位など) に対して直径約 2 mm × 4 mm の開頭術を実行しました。 皮質を覆う硬膜は無傷のまま保たれた。 組織の動きは、露出した組織を 1% アガロース溶液とカバースリップで覆うことによって制御されました。 カバースリップを、Vetbond (3 M) および歯科用セメントを使用して頭蓋骨に貼り付けました。 皮質へのプローブの進入を可能にするために、アガロースとカバースリップの片側を開頭術と面一になるように切断しました。 光学窓の準備後すぐに記録を開始しました。 麻酔の深さは実験全体を通して監視され、毎分約 55 ～ 65 回の呼吸数を維持するために必要に応じて調整されました。 体液損失を補うために、必要に応じて生理食塩水を補充した。

覚醒状態での電気光学測定では、まずマウスを球形トレッドミルでの頭部拘束に慣れさせた（通常、3 セッション、1 セッションあたり 30 ～ 90 分、連続 3 日間で 1 日あたり 1 セッション）。 慣れた後、全身麻酔下で標的領域（バレル皮質、座標：AP -1.0 mm、ML 3.0 mm）上で直径約0.3〜0.5 mmの開頭術を実施しました。 次に、マウスを球形トレッドミルに移し、麻酔時間に応じて少なくとも 30 ～ 60 分間麻酔から回復させました。 電気光学測定に続いて、最初にプローブ/組織界面を 1% アガロース溶液で覆い、次に Vetbond (3 M) と歯科用セメントを塗布することにより、プローブを所定の位置に固定し、それによってフェルールを頭蓋骨に固定しました。 マウスをホームケージで回復させた後、別の日にその後の記録を行った。

in vivo での EO-Flex プローブの電気生理学的特性を特徴付けるために、以前の研究と同様に、イソフルランで麻酔をかけ覚醒したマウスの皮質で細胞外の単一ユニットおよびマルチユニット記録を実行しました 23,24。 EO-Flex プローブの電気チャネルは、カスタム アダプターを使用して高インピーダンス ヘッド ステージ (モデル 1800 微小電極 AC アンプ、AM Systems) のプラス端子に接続され、マイナス端子とアースは挿入された Ag/AgCl ワイヤーに接続されました。小脳皮質の上。 このアダプターは、パッチケーブル端が埋め込まれたセラミックブロックと、単一コアのヘッドステージワイヤーにはんだ付けされた取り外し可能な銅製クリップで構成されていました。 EO-Flex プローブは、フェルール スリーブをパッチ ケーブル端にスライドさせ、プローブをこのアセンブリにスライドさせてから、銅クリップを下げて EO-Flex フェルール上の金属層に接触させることにより、このアダプタと嵌合しました。

標的組織への挿入とプローブの正確な位置決めを可能にするために、アダプターを電動マイクロマニピュレーター (MP-225、Sutter Instrument Company) に取り付け、頭蓋骨に対して所定の角度 (たとえば、イメージングと電気生理学を組み合わせた場合は約 60 度) に向けました。 、イメージングなしの測定の場合は ~0 度)。 EO-Flex プローブの先端を開頭術の端近くに配置した後、組織界面を通した機械的挿入を容易にするために、数滴の生理食塩水を頭蓋骨の開口部にピペットで滴下しました (図 2a)。

正確な位置決めは、差動アンプの出力をスピーカーに通し、プローブがアクティブなセルに近づいたときの聴覚フィードバックとして機能することによって支援されました。 生の電極信号は増幅され、フィルタリングされ（低カットオフ、300 Hz、高カットオフ、5 kHz、ゲイン、1000 倍）、デジタル化され（20 kHz、DAQExpress 2.0 を使用）、オフライン分析のためにディスクに保存されました。 。 神経細胞体の近くにプローブの先端を配置することは、蛍光指示薬を発現するトランスジェニックマウスのイメージングを伴う実験における視覚的フィードバックによってさらに助けられた。

電気刺激（図S5）には、独立したパルス刺激装置（モデル2100; AM Systems）を使用したEO-Flexプローブ媒介の電流パルス送達（振幅0〜300μA、刺激周波数100Hz、パルス幅0.2ms、刺激期間1Hz）が含まれていました。 ) 関数発生器に接続されています。

特定の半球のバレル皮質は、体の反対側にあるひげから感覚入力を受け取ります。 プローブの記録位置の反対側にヒゲを偏向させるため、プラスチックチューブを介して関数発生器制御の圧力システム (Picospritzer III; Parker Hannifin Co.) に接続されたマイクロピペットを使ってエアパフを送達しました。 関数発生器はまた、動物の外側だがビデオカメラの視野内に配置された赤外線 LED を操作して、アナログデータとビデオデータを同期させました。 マイクロピペットは電動マイクロマニピュレーター (MP-225、Sutter Instrument Company) に接続されており、刺激されるひげを正確に制御できます。 空気圧は皮膚および目から遠ざけられ、吻尾方向に送られました。 エアパフ刺激は、2 秒間の「オン」とそれに続く 2 秒間の「オフ」で構成され、パルス周波数 (2 ～ 5 Hz) と幅 (20 ～ 100 ms) を変化させました。

in vivo イメージングは​​、パルスフェムト秒 Ti:Sapphire レーザー (Chameleon Ultra II、Coherent)、2 つの蛍光検出チャンネル (発光フィルター: ET525/70 M および ET605/ 70 M (Chroma)、ダイクロイック ビーム スプリッター: 565DCXR (Chroma)、光電子増倍管: H7422-40 GaAsP (Hamamatsu))、および MPScope 画像取得ソフトウェア (Kleinfeld lab、UCSD)。 レーザー励起波長は920nmに設定した。 平均レーザー出力は組織表面で 10 ～ 15 mW 未満で、散乱と吸収による信号損失を補償するために深さによって調整されました。 光の伝達と集光には、16×0.8 NA (CFI75、Nikon) または 40× 0.8 NA (LUMPLFLN、Olympus) の水浸対物レンズを使用しました。 自発的および光学的に誘発されたカルシウム活性が、プローブ先端近くの光学面で記録されました (フレームレート、8.14 Hz)。 電気記録におけるベクレル効果を介したアーチファクトを最小限に抑えるために、イメージング レーザーの出力は最小限に保たれました。 光遺伝学的実験で光学的に誘発されたカルシウムトランジェントを記録するために、画像フレームレートを光パルス列の配信と同期させ、DPSSレーザーがオフのときにプローブ先端の前の領域がスキャンされるように位相を調整しました（図S12）。

それぞれ ChR2 または C1V1 を励起するために、外部関数発生器信号によって直接変調された 200 mW 473 または 556 nm DPSS レーザー (CNI) からの光がプローブに結合されました。 プローブへの光結合は、フェルールの研磨された端をセラミックスリーブに滑り込ませ、次にそれをカスタムファイバーパッチケーブルの端に滑り込ませることによって達成されました。 各刺激トライアルは約 60 秒続き、最初の 5 ～ 10 秒は光パルス列が送達される前の自発的活動を記録するために指定されました (刺激出力、6 ～ 208 μW、パルス幅、0.6 ～ 9.8 ミリ秒、刺激周波数、10 ～ 50 秒)。 Hz、持続時間、1 秒、刺激間間隔、パルス列間の間隔 1 秒）。

標識ミクログリアを持つヘテロ接合型 Cx3cr1-GFP マウス (雄、9 週齢) の反対側の半球 (正中線から ±1.45 mm) に、光遺伝学的脳深部刺激に適した EO-Flex プローブと直径 250 μm のマルチモード ファイバーを移植しました。 移植では、溝付きビット（先端直径 0.5 mm）を備えた電気マイクロドリルを使用して、骨の直径 0.5 ～ 1 mm の部分を薄くしました。 骨が軽く曲がるほど十分に薄くなったら、付属の注射器を備えた滅菌 30 G 針を使用して、骨の小さな部分 (0.3 ～ 0.4 mm) を慎重に切断し、持ち上げます。 コンピュータ支援定位システム (Angle Two、Leica) を使用して、プローブまたはマルチモード ファイバーを視覚制御下でこの開口部を通って約 1 mm の深さまで進めました。 デバイスを所定の位置に固定するために歯科用セメントが使用されました。 歯科用セメントの頭蓋骨への強固な結合は、骨スクレーパー (Fine Science Tools) で削ることによって促進されました。 手術とプローブ関連の組織反応を区別するために、デバイス移植部位から 0.7 mm 側方に追加の開頭術を実行しました (図 S14、S15)。 組織の炎症反応を評価するために、IACUC ガイドラインに従って CO2 窒息を使用してデバイス移植後 6 日または 30 日後にマウスを屠殺しました。 経心臓灌流は、ＰＢＳ中の１０％スクロース、続いて新たに調製したＰＢＳ中の４％ＰＦＡを用いて実施した。 両半球をＰＢＳ中４％ＰＦＡ中で一晩後固定し、続いてＰＢＳ中３０％スクロース中に１日間浸潤させ、ＴＢＳ組織凍結培地中で急速凍結した。 移植された半球を冠状に 20 μm で凍結切片化し、一晩風乾し、続いて染色のために処理しました。 切片をブロッキングバッファーで希釈した一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートし、その後 PBS 0.1% Tween-20 で洗浄し、蛍光団結合二次抗体とともに暗所で 22 ～ 24 °C で 2 時間インキュベートしました。 切片を洗浄し、Prolong Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific) で密封し、4 °C で保存しました。 一次抗体には、抗 GFAP (マウス モノクローナル; EMD Millipore; カタログ番号 MAB3402; RRID: AB_94844; 1:250 希釈) および抗 NeuN (ウサギ ポリクローナル; EMD Millipore; カタログ #ABN78; RRID: AB_10807945; 1:100) が含まれていました。希釈）。 二次抗体 (1:100) には、Alexa Fluor 405 ヤギ抗ウサギ (Thermo Fisher Scientific; カタログ番号 A-31556; RRID: AB_221605) および Alexa Fluor 633 ヤギ抗マウス (Thermo Fisher Scientific; カタログ #A-21052) が含まれていました。 ; RRID: AB_2535719)。 染色された組織切片の共焦点イメージングは​​、Zeiss LSM 710 (ソフトウェア: ZEN Black、Zeiss v2011) で実行されました。 組織全体の切片の画像を生成するために、3 チャネルのタイル化された Z スタックが取得されました (図 5 および図 S14、S15)。 画像サイズは 1024 × 1024 ピクセルで、3 ～ 5 × 3 ～ 5 のタイルにステッチされました。 画像はオリンパス 20 × 0.8 NA 空気適合対物レンズを使用して撮影されました。

神経活動は、その振幅が \({{{{\rm{Threshold}}}}}}=4* {{{{{\rm{median}}}}}}\ で決定されるしきい値を超えた場合にスパイクとみなされます。 left(\frac{{{{{\rm{|Recording|}}}}}}}{0.675}\right)\) 36. 次に、観察されたすべてのスパイクは、最初の 2 つの主成分に従ってクラスターに分類されました。 MATLAB (R2019b) で計算されたクラスター分析用の Calinksi-Harabasz メトリックに従って最適化されたクラスター数による混合ガウス フィッティング。 平均発火率は、Bayesian Adaptive Kernel Smoother (BAKS) (v2017; https://github.com/nurahmadi/BAKS) を使用して計算されました。 モンテカルロシミュレーションを使用して、さまざまな倍率でのEO-Flexプローブの伝播と照射量を決定しました（図S6b）。

光遺伝学的加熱プロファイルは、ペンヌの生物熱方程式を利用した以前のモデル 29 を使用して作成されました。 シミュレーションパラメータは、EO-Flexプローブの光学半径1.8μm、波長470nm、出力1mWまたは208μW、時間ベースのシミュレーションでの温度平均化のための円筒半径10μmのものでした（図S7）。 ）。

光刺激とスパイキングイベントを相関付けるペリスティミュラスプロットは、カーネル帯域幅最適化を使用して計算され、基礎となるスパイクレートを正確に推定することが示されています（図4b）25。

二光子カルシウムイメージングデータの解析は、Suite2pを使用して実行されました（図S12）38。 光学的に誘発されたカルシウムスパイクが、プローブ先端近くの光学面で観察されました。 我々の分析は、刺激期間を通じて少なくとも 3 つの細胞サイズの関心領域 (ROI) が一貫して応答する光学面に焦点を当てました。

免疫染色データは、ImageJ (v1.53f51)、Imaris (v9.2; Oxford Instruments)、および Prism (v8.4.3; GraphPad Prism) ソフトウェアを使用して処理、分析、およびプロットされました。 すべてのデータは平均±標準誤差として表されました。グループのサンプルサイズは以前の研究と検出力分析に基づいて選択されました。 両側対応のある t 検定により P 値を決定しました。 P 値を示すために次の規則が使用されました。「ns」は P > 0.05 を示し、「*」は 0.01 < P ≤ 0.05 を示し、「**」は 0.001 < P ≤ 0.01 を示し、「***」は 0.0001 < P ≤ を示します。 0.001。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

ソースデータはこのペーパーに付属しています。 この研究の結果を裏付ける追加データは、要求に応じて対応著者から入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

データの処理と図の作成に使用されるカスタム コードは、GitHub (https://github.com/Spencer-W/EO-Flex-Algorithms.git) で入手できます。 ご要望に応じて対応著者からも入手可能です。

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博士らに感謝したいと思います。 Anis Husain と Rob Saperstein (Ziva Corporation) には、初期の EO-Flex プロトタイプと設計の技術的な議論と電磁シミュレーションを担当していただきました。 また、光遺伝学実験に関する技術支援をいただいた Pavel Shekhtmeyster (Salk Institute) と、電気生理学的データ分析に関するアドバイスをいただいた Ben Temple および Elischa Sanders (Salk Institute) に感謝いたします。 さらに、クリーンルームプロセスに関する議論と支援をしていただいた Samir Damle (UCSD) に感謝いたします。 この研究は、DARPA 契約管理局助成金/契約番号 HR0011-16-2 を通じて、ダグラス ウェーバー博士の後援の下、国防高等研究計画局 (DARPA) 生物技術局 (BTO) 電気処方箋 (ElectRx) プログラムによって後援されました。 -0027 (DJS、SE、AN へ)。 このプロジェクトは、UCSD Kavli Institute for Brain and Mind (DJS および AN への助成金番号 2018-1492)、および米国国立衛生研究所 (AN への R01 NS108034、U19 NS112959、および U01 NS103522、および AN への P30CA014195) によっても支援されました。ソーク研究所）。 この研究の一部は、米国科学財団 (カリフォルニア大学サンディエゴ校への助成金 ECCS-1542148) の支援を受ける国家ナノテクノロジー調整インフラストラクチャーのメンバーである UCSD のサンディエゴ ナノテクノロジー インフラストラクチャー (SDNI) で行われました。

カリフォルニア大学サンディエゴ校、電気およびコンピュータ工学部、ラホーヤ、カリフォルニア州、92093、米国

スペンサー・ウォード & サディク・エゼナー

カリフォルニア大学サンディエゴ校ナノエンジニアリング学部、ラホーヤ、カリフォルニア州、92093、米国

コナー・ライリー、ジェニー・グエン、サディク・エセナー、ドナルド・J・サーベリー

Waitt Advanced Biophotonics Center、ソーク生物学研究所、ラホーヤ、カリフォルニア州、92037、米国

エリン・M・キャリー & アクセル・ニンマーヤーン

材料科学および工学、カリフォルニア大学サンディエゴ、ラホーヤ、カリフォルニア、92093、米国

ドナルド・J・サーブリー

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SW、CR、SE、AN、および DJS がプローブを概念化しました。 SW、CR、および JN はプローブを製造、特性評価、およびテストしました。 SW、EMC、および AN が生物学的実験を実施しました。 SE、AN、DJS が資金を確保し、研究を監督しました。 SW、AN、DJS がデータを分析し、論文を執筆しました。 著者全員が原稿をレビューし、編集しました。

Axel Nimmerjahn または Donald J. Sirbuly との通信。

カリフォルニア大学サンディエゴ校は、SW、CR、SE、AN、DJS が共同発明者として、この研究に関する特許出願を行っています (出願番号 63/076,328)。 残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Guosong Hon と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Ward, S.、Riley, C.、Carey, EM 他内因性神経回路との低侵襲インターフェース用の電気光学機械的に柔軟な同軸マイクロプローブ。 Nat Commun 13、3286 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-30275-x

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受信日: 2020 年 11 月 10 日

受理日: 2022 年 4 月 22 日

公開日: 2022 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30275-x

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