微生物燃料電池の改質黒鉛アノード上に発達した起電性バイオフィルムの細菌群集構造

Scientific Reports volume 13、記事番号: 1255 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

電極上での起電性微生物バイオフィルムの形成は、微生物バイオ燃料電池 (MFC) で廃水から電力を回収するために重要です。 バイオフィルム内の細菌群集構造に関する知識は、MFC 電極の合理的な設計に不可欠ですが、この主題に関する詳細な研究はまだ待たれています。 ここでは、空気陰極 MFC に組み立てられた修飾黒鉛陽極上に起電性バイオ フィルムを作成することで、この問題に対処しようとします。 修飾は、還元酸化グラフェン (rGO)、ポリアニリン (PANI)、およびカーボン ナノチューブ (CNT) を個別に使用して実行されました。 バイオフィルムの成長を促進するために、アノードの製造中に大豆とジャガイモの複合体（植物）粉末がこれらの導電性材料と混合されました。 PANI ベースのアノードで製造された MFC は 324.2 mA cm-2 の電流密度を供給し、次に CNT (248.75 mA cm-2)、rGO (193 mA cm-2)、ブランク (コーティングなし) (151 mA cm-2) が続きました。 2) グラファイト電極。 同様に、PANI ベースのアノードは、細胞の多様な形状とサイズ、および幅広い代謝機能を備えた最大の細菌細胞密度を含む堅牢なバイオフィルムの成長をサポートしました。 ハイスループット 16S rRNA 配列解析から明らかになったように、PANI でコーティングされたアノード上に発達したバイオフィルムのアルファ多様性は、最も高い操作分類単位 (2058 OUT) およびシャノン指数 (7.56) でした。 さらに、これらの分類単位内では、プロテオバクテリア、ファーミクテス属、およびバクテロイデス属を含む体外発生門が最大であり、対応するレベル (%) は 45.5、36.2、および 9.8 でした。 PANIベースのアノードでは、クラスレベルではガンマプロテオバクテリア、クロストリジウム菌、桿菌が相対的に多く、属レベルではシュードモナス属、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、ビフィズス菌が比較的多かった。

廃水管理に使用される生物ベースのプロセスは、化学的および物理的なプロセスに比べて運用コストが低く、操作が簡単です1。 効率を向上させ、バイオベースの処理プロセスに付加価値をもたらし、実際の用途でその可能性を最大限に発揮する取り組みが続けられています2。 生物電気化学システム (BES) を使用して廃水中の有機化合物を価値のある誘導体に変換することは、さまざまな実装が期待できるため、ますます注目を集めています。 微生物燃料電池（MFC）は、電気活性微生物を使用して廃水域に存在する生分解性有機化合物を分解し、同時に生物電気化学変換戦略を通じて生物電力を生成する可能性があるため、このバイオテクノロジーのベンチャーへの魅力的な追加物です4。 この変換プロセスの中心となるのは、廃水環境中の自然の微生物集団であり、MFC 電極にバイオフィルムとしてコロニーを形成し、生体触媒活性を通じて変換プロセスを開始します 5,6。 しかし、廃水中に存在する複雑な有機物質を、自然に発生した細菌バイオフィルムを介して生体電極触媒で変換するプロセスは長期間に及び、開放環境条件における廃棄物の蓄積ダイナミクスに対処するのに十分な能力を備えていません。 この課題を引き起こす重大な問題の 1 つは、陽極表面上での起電性バイオ フィルムの形成が遅いことです。 したがって、電極表面での微生物バイオフィルム電気泳動の誘導は、MFC ベースのバイオプロセス技術における重要な研究分野です7。

MFC で電力を採取するための電極表面上での起電性微生物バイオフィルムの開発に関する科学的レポートが多数入手可能です8,9。 電子は電気化学的に活性な微生物、最も一般的にはバクテリアであり、MFC セットアップで有機化合物を分解し、生成された電子を電極に転送することによって電気エネルギーを生成します10、11。 電極 (主にアノード) 表面上でのこれらの電極のバイオフィルム形成は、MFC で必要な電力を生成するために、廃水中の有機化合物の酸化から十分な代謝電子を収集するための前提条件です。 細菌バイオフィルムを作成し、MFC の電力を向上させるために、電極と電極上のコーティング材料のスクリーニング 14,15、ベース電極とバイオフィルムの化学的結合 16、ナノ加工 17、電極製造のための環境廃棄物のスクリーニング 18 など、さまざまな戦略が研究されています。 電極材料の中で、炭素ベースの材料は、バイオフィルムの電気化学的性能を強化する有望な電極として浮上している 19,20。

さらに、グラファイト/金属、カーボンクロス/金属、カーボンナノチューブ/金属、およびその他の多くのポリマー複合材料を含む、複合ベースの電極材料に関するいくつかの研究が文書化されています21、22。 これらの研究のほとんどは、MFC の電気的性能に対するアノード材料の影響を調査しました。 一般に、これらの努力は、この主題に関する漸進的な進歩に貢献してきました。 しかし、実際の応用に向けた BFC の合理的な設計には、バイオフィルムの細菌群集を包括的に理解することが不可欠です 23。

この調査の主な目的は、燃料源として活性汚泥と細菌を供給した局所設計の MFC システムの陽極表面に発達した起電性バイオ フィルムの細菌群集構造を調査することです。 一般に一次電極として使用されるグラファイト材料を使用し、電極修飾後のアノード表面上の起電性バイオフィルムの形成を、利用したさまざまな導電性複合材料で精査し、バイオフィルムの発達に最適な支持材料を選別しました。 修飾グラファイトアノード上で細菌バイオフィルムを即座に誘導するために、コーティング複合材料として炭水化物とタンパク質の含有量が高い植物混合物を使用しました。 ハイスループット 16S rRNA 遺伝子配列解析を使用して、バイオフィルム内の門、綱、種レベルでの微生物群集構造を解析しました。 この論文では、表面改質グラファイトアノードの細菌群集プロファイルと、それに関連する MFC の電気的性能に関する結果の詳細な説明が記載されています。

ポリアニリン (PANI)、カーボン ナノチューブ (CNT)、還元酸化グラフェン粉末 (rGO)、およびプロトン交換膜 (PEM: Nafion 117) は Sigma-Aldrich から購入しました。 Luria Bertani (LB) 寒天培地は Himedia Labs (インド) から購入しました。 15〜20%の炭水化物を含むジャガイモパウダーは、洗浄したジャガイモをミキサーグラインダーで粉砕し、次に微細なペーストをガラスのペトリ皿に抽出することによって調製されました。 次いで、ペーストを熱風オーブン内で６０±５℃で一晩焼成し、得られた微粉末を室温まで冷却した。 地元の市場から購入した生の乾燥大豆から、タンパク質を 36 ～ 58% 含む大豆粉末を調製しました。 乾燥大豆をミキサーグラインダーを使用して適切に粉砕し、最も細かい粉末状にしました。 最後に、ジャガイモと大豆の粉末を 1:1 で混合して均質なジャガイモと大豆 (植物) の粉末を生成し、その後使用するために 4 °C で保存しました。 実験全体を通じて、Millipore Co. の脱イオン水 (18.2 MΩ cm) を使用しました。 植物/植物材料の収集に関する研究は、関連する制度的、国内的、国際的なガイドラインおよび法律に準拠しています。 使用した試薬はすべて分析グレードのものであり、さらに精製することなく受け取ったまま使用しました。

寸法（2.0 cm × 2.0 cm × 0.3 cm）のグラファイトプレートを導電性アノード電極として使用しました。 以下のように、黒鉛電極上に複合材料をコーティングすることによって、３つの異なるアノードを製造した。Ｓ１：対照（コーティングなし）。 Ｓ２：植物粉末とｒＧＯの複合懸濁液（大豆：ジャガイモ：ｒＧＯの比率が１：１：０．５ｗ／ｗ）。 Ｓ３：植物粉末とＰＡＮＩの複合懸濁液（大豆：ジャガイモ：ＰＡＮＩの比率が１：１：０．５ｗ／ｗ）。 S4: 植物粉末と CNT の複合懸濁液 (大豆:ジャガイモ:CNT の比率が 1:1:0.5 w/w)。 非白金化ガス拡散電極は空気陰極として適用され、以前に説明したように VITO (ベルギー) で製造されました 24。 電極は、次のセクションで説明する構成の MFC セットアップで組み立てられました。 MFC の動作前に、準備したアノード電極を、インドのアッサム州 IIT グワハティにある下水処理場から収集した 50 mL の家庭汚泥が入ったファルコン チューブ内に配置しました。 チューブを 35 °C ± 2 °C のインキュベーター内に 30 日間保管して、アノード上でのバイオフィルムの成長を誘導しました。

総作業量 50 mL の単一チャンバーの空気陰極 MFC が構築されました (図 1)。 陽極室の陽極液は、活性汚泥をｐＨ７．６１のリン酸緩衝液で４：１の比率で希釈することによって調製した。

作製したチャンバー付き MFC システムの構成。 長方形のチャンバーはポリアクリルプラスチック製で、総液体量は 50 mL でした。 陽極室の寸法（長さ×幅×高さ）は８０×８０×３０ｍｍであった。

MFC は、追加の炭素と燃料源を使用せずに、陽極チャンバー内で特定の汚泥:PBS (4:1) の比率で PBS で希釈した 50 mL の活性汚泥を使用して操作されました。 細菌細胞密度の初期対数カウントは 107 CFU/mL でした。 上述したように、作製したアノードをアノードチャンバーに浸漬した。 陽極チャンバー内の酸素欠乏状態は、陽極液の接種後、MFC を操作する前にアルゴンガスを 10 分間パージすることによって開始されました。 開路電位 (OCP) が安定したら、銅線を介して外部負荷 (1 kΩ) を接続し、MFC から電流を引き出しました。 MFC は 25 °C でバッチ モードで 45 日間動作しました。 MFC によって生成された電流は、データ収集システム (Agilent 34972 A LXI、米国) によって 10 分ごとに記録されました 25。

アノード表面上に発達したバイオフィルム細胞集団は、寒天平板法を使用して生存可能なバイオフィルム細胞を計数することによって、定期的な 2 日間隔で監視されました。 陽極電極表面に形成されたバイオフィルムは生理食塩水で 3 回洗浄され、滅菌綿棒を使用して表面領域の細胞から剥離されました 26。 収集したスワップを10mlの食塩水ガラス試験管に入れた。 次いで、チューブをボルテックスを使用して10分間撹拌して、スワップのバイオフィルム細胞を剥離した。 細胞生存率アッセイは、剥離したバイオフィルム細胞懸濁液 1 ml を、35 °C で 10 ～ 15 ml の LB 寒天を含む滅菌寒天皿に移すことによって実行されました。 次に、プレートを 35 °C のインキュベーターに一晩置き、寒天表面上で細菌コロニーを増殖させました 27。

アノード上に発達したバイオフィルムの形態学的側面を、3 keV EHT、50 mm 口径の FESEM (メーカー: Zeiss、モデル: Sigma) を使用して検査しました。 イメージングの前に、バイオフィルムでコーティングされた電極を 2.5% グルタルアルデヒド溶液で 4 時間の保持時間固定し、低イオン性 20 mM リン酸カリウム緩衝液、pH: 7.3 (PBS) を使用して洗浄しました。 その後、電極は 10 ～ 100% の勾配アルコールシリーズを使用して各段階で 30 分間、非常に穏やかに定期的に撹拌しながら脱水され、その後完全に乾燥されました 28。 乾燥したサンプルは真空乾燥され、スタブに取り付けられ、金でスパッタリングされ、画像が撮影されました 29。

実験プロセス (45 日) の最後に、アノード電極を MFC 反応器から取り出し、流水で注意深く洗浄して付着した破片を取り除きました。 滅菌メスを使用して、アノード電極上に発生した微生物バイオフィルムを削り取りました。 掻き取った陽極バイオフィルムを、10mlの50mM PBSを含む滅菌50mlチューブに堆積させた。 最終的なバイオフィルムサンプルは DNA 抽出に割り当てられました。

収集したバイオフィルムサンプルの全ゲノム DNA を、PowerSoil DNA 単離キット (MoBio Laboratories Inc.、米国) を製造元のプロトコールに従って使用して抽出しました。 単離された DNA 抽出物の強度と純度は、NanoDrop 8000 分光光度計を使用して λ260nm および λ280nm での吸光度を測定することによって検査されました。 すべてのバイオフィルムサンプルの単離された DNA は、下流分析の前に -80 °C に維持されました 30。

細菌 16S rRNA 遺伝子の V3 ～ V4 超可変領域は、以下のような一対のユニバーサル細菌プライマーを使用したサーモサイクラー PCR システムを使用して増幅されました: 16SrRNAF: (5'-GCCTACGGGNGGCWGCAG-3') および 16SrRNAR: (5 '-ACTACHVGGGTATCTAATCC-3')。 PCR増幅は、次のサーマルサイクルプログラムを使用して実施しました：95℃で3分間の初期変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で45秒の伸長（最終伸長は10分間）。 得られた PCR 産物は、PCR 産物 3 μl を 1.2% アガロースゲル電気泳動に加え、約 60 分間、またはサンプルがゲルの 3/4 に達するまで分離しました31。

NGS は、MiSeq Illumina シーケンス技術を使用して実行され、16S rRNA 遺伝子の V3 ～ V4 超可変領域に焦点を当て、陽極バイオフィルム内の微生物集団の動態を調査しました。 アンプリコンライブラリーは、Nextera XT Index Kit (Illumina inc.) を使用して、16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Protocol (Part # 15044223 Rev. B)8 に従って調製しました。 特定の領域を増幅するためのプライマーは、インドの Eurofins Genomics Lab で設計および合成されました。 イルミナアダプターを備えた QC 合格アンプリコンは、標準イルミナプロトコルに従って、多重化インデックス配列とクラスター生成に必要な標準アダプター (P5 および P7) を追加する i5 および i7 プライマーを使用して増幅されました。 イルミナオーバーハングアダプター配列は以下の通りであった:前方オーバーハング:5'(CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG)および逆方向オーバーハング:5'(GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG)。 アンプリコン ライブラリを AMPure XP ビーズで精製し、Qubit Fluorometer を使用して定量しました。 増幅されたライブラリーは、メーカーの指示に従い、D1000 スクリーン テープを使用して 4200 テープ ステーション システム (Agilent Technologies) で分析されました。 等モル量のすべてのサンプルを 1 つのチューブにプールしました 32。 アンプリコンライブラリープールの配列決定は、Illumina MiSeq プラットフォーム (Eurofins Genomics India Pvt. Ltd.) で実行されました。

FASTQC はペアエンドの読み取りデータを精製しました。 Trimmomatic v0.38 を使用して、アダプター配列、あいまいなリード (5% を超える未知のヌクレオチド「N」を含むリード)、および低品質の配列 (品質しきい値 (QV) が 10% を超えるリード) を除去した後、高品質のクリーンなリードが取得されました。 < 20 Phred スコア)、スライディング ウィンドウは 10 bp、最小長は 100 bp です。 シングルエンド読み取りは、FLASH (v1.2.11) ソフトウェア ツールを使用してマージされました。 高品質のペアエンドリードは、バイオインフォマティクス ワークフロー Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME) ソフトウェア バージョン 1.8.033 を使用して分析されました。 操作分類単位 (OTU) は、リード内の配列類似性に基づいて選択されました。 分類法は、Greengenes データベース (バージョン 13_8) に対して割り当てられました。 Greengenes 参照データベース (バージョン 13.8) を使用した Uclust メソッドを適用して、高品質のクリーン リードを配列類似性 97% 以上の OTU にクラスター化しました 34。 各サンプルのアルファおよびベータ多様性メトリクスが計算されました。 出力データを表示し、サンプル間の違いをグラフで示すために、主座標図 (PCo) が作成されました。 UPGMA を使用した非加重ペア グループ法を使用して、MEGA-X を使用して系統樹を確立し、その系統樹を ITOL v.535 を使用して視覚化しました。 微生物群集の推定された生態学的および代謝機能は、FAPROTAX データベース 36 を使用する Python の多用途スクリプト (collapse_table.py) を使用して分類学からマッピングされました。 すべての統計調査と視覚化は、R バージョン 3.6037 によって実行されました。

データの統計分析は、GraphPad Prism バージョン 5.0 (米国) を実行することによって実行されました。 取得した値は平均値±標準偏差（STDEV）で表した。 二元配置分散分析 (ANOVA) を実行して、バイオフィルム細胞数とバイオフィルム年齢 (日) の間の有意性を定義しました。 値間の差異は、p 値 < 0.05 で統計的に有意であると仮定されました。 すべての実験操作は独立して 3 回実行されました。

この記事には、著者らによって行われた人間の参加者または動物を対象とした研究は含まれていません。

今回の調査で燃料および微生物源として使用した活性汚泥の物理化学的特性は次のとおりです。pH 7.12、COD 2015 mg O2 L−1、電気伝導度 4492 μS cm−1、総溶解固形分 2247 mg L−1、有機物含有量65%、無機含有量35%。 バイオフィルムを短時間で作成するために、ジャガイモ粉末と大豆粉末という 2 つの天然生体材料が検討されました。これらの材料は、炭水化物 (15 ～ 20%) とタンパク質 (36 ～ 58%) を多く含むことが知られています。 、それぞれ、急速な細菌の増殖に適切な栄養素です。 外部抵抗 1 K でのバッチ サイクル操作を使用して、4 つの MFC システムでの発電を調査しました。 42日間の微生物培養後、4つのMFCは電流密度と電力密度の反復可能なサイクルを確立し（図2a、b）、バイオフィルムの生成と細菌の付着がアノード電極上で定常状態に達したことを示しました。 活性汚泥水中での電流密度（mA cm-2）と出力密度（mW cm-2）の生成に関して、バイオフィルム成長アノード（S1、S2、S3、およびS4）を備えたMFCの電気的性能を調べました。 アノード S1、S2、S3、および S4 の最大電流出力 (mA cm-2) は 7 日間で到達し、それぞれ 151、193、324.2、および 248.75 でした。 現在の生産順序は、MFC-S3 > MFC-S4 > MFC-S2 > MFC-S1 でした。 MFC-S3では324.25 mA cm-2の最高電流密度が得られ、これはMFC-S1で生成された電流（151.2 mA cm-2）よりも約2倍高くなりました（図2a）。 さらに、図2bに示す結果は、最大電力密度がMFC-S3システムによって生成され、値が256.4 mW cm-2であり、MFCではそれぞれ230.8、148、91.5 mW cm-2が続いたことが示されています。 -S4、MFC-S2、および MFC-S1 システム。

(a) 電流密度、(b) 異なるアノードで構成された MFC (MFC-S1、MFC-S2、MFC-S3、および MFC) の外部抵抗として 1 K Ω を使用した場合の時間 (日) の関数としての電力密度出力-S4) 活性汚泥を燃料として使用する、(c) 異なる電極上でのバイオフィルム細胞の増殖速度の定量分析。 各データ ポイントは、P 値 = 0.0001 における n = 3 の平均です。 セル密度は電極の単位表面積 (cm2) ごとに計算されます。

図２ｃに示される結果は、４つの異なるアノード（Ｓ１〜Ｓ４）上でのバイオフィルムの成長を示している。 図から明らかなように、バイオフィルム細胞のレベルはすべての電極で時間の経過とともに増加し、微生物密度は 26 日間のインキュベーション後に最大に達しました。 バイオフィルムの蓄積は S3 ではるかに顕著で、続いて S4、S2、および S1 では、修飾されていないアノードと比較して膨大な数のバイオフィルム細胞が修飾されたアノードに引っ掛かっていました。 S1、S2、S3、および S4 でのインキュベーション 26 日目に識別されたバイオフィルム細胞の集団は、それぞれ 6.65 ± 0.24、7.4 ± 0.31、8.75 ± 0.18、および 8.19 ± 0.29 log CFU/cm2 でした。 我々は、上記の PANI の物理化学的特性が、この場合、これらのグラフェンベースの材料の導電特性を上回る優れたパラメーターであり、バイオフィルムのより高い起電力挙動とそれに関連した MFC での電流生成を誘導すると提案します。 起電活動とコンクリート陽極への電子輸送を促進する起電性細菌の優先的な培養は、慣れ親しんで閉回路環境で動作する陽極バイオフィルムによって実現されます8。

運転期間の終了時にアノード表面上に形成されたバイオフィルムのFESEM顕微鏡写真を図3に示します。結果は、電極上に形成されたバイオフィルムが、異なるテクスチャーと細胞集団密度を備えたコーティングされたマトリックスに大きく包まれていることが指摘されました。 MFC-S3システムでは、PANIと植物粉末でコーティングされたアノード表面全体が、高密度で厚いバイオフィルムで覆われていました。 さらに、MFC-S3システムで形成されたバイオフィルムは、さまざまな形状の細菌細胞を含み、棒状および円形を含むため、多様な形態学的外観を持っていました（図3c）。 修正された電極の残りの部分（S2およびS4）では、さまざまな形状とサイズの細菌細胞が見えたにもかかわらず、全体の細胞密度はS3よりも大幅に薄かった（図3a〜d）。 結果は、MFC-S3 での凝集が他のコーティングされたアノードおよびコーティングされていないアノードよりも顕著であることを報告しました。 コーティングされていないグラファイトアノード（S1）上に形成されたバイオフィルムは、厚さと不均一性の点で他の電極よりもはるかに小さかった（図3a〜d）。 電極バイオフィルムの複雑なマトリックスに存在する電気活性微生物は、図3に示すように、MFC内で生物学的電極触媒として機能し、電流を生成します。このように高密度に圧縮されたバイオフィルム細胞は、有機物質を分解することによって容易に大量の電子を生成することができ、その結果、有意な電気エネルギーが得られます。陽極液に蓄えられた化学エネルギーの生物変換効率。 より本質的には、コーティングされた導電性材料上の正電荷は、負に帯電したバイオフィルム細胞との電極触媒活性の関与を促進し、陽極液（廃水）からの起電性細菌のアノード表面への迅速な付着および定着をサポートする。

45 日間の操作後に撮影された (a) MFC-S1、(b) MFC-S2、(c) MFC-S3、および (d) MFC-S4 の陽極バイオ フィルムの形態の FESEM 顕微鏡写真画像。

起電性バイオ フィルムの微生物群集解析は、16S rRNA 遺伝子のハイスループット シーケンスによるメタゲノム解析によって実行され、起電性細菌バイオ フィルムの存在量と多様性を調査しました。 バイオフィルム内の細胞の定量化には、プラットカウント法が考慮されました30。 作製されたアノード上での MFC 操作の終了時に形成された電気活性バイオフィルム内の微生物群集プロファイルを、以下のセクションで説明するように調査しました。

図4aに示すように、16S rRNA遺伝子の配列分析から、S1〜S4サンプルから生成されたリードが記録されました。 観察された OTU は 97% のヌクレオチドで特定されました。 観察された OTU、Ace、および Chao1 推定値から、S1 リアクターのアノード バイオフィルムが最も低く、S3 リアクターの微生物存在量が最も高いことが明らかになりました。 シンプソンの多様性は、S1 原子炉の 0.855 から S3 原子炉の 0.982 に増加しました。 S1 対 S2 対 S3 対 S4 における OTU レベルの分類学的存在量は、273、572、2085、および 1334 でした。同様に、シャノンおよびシンプソンの多様性指数も S3 バイオフィルムで最大でした。 一般に、微生物多様性指数は他の電極と比較して S3 バイオフィルムで最も高く、植物混合物と PANI のコーティング複合体が電極上での微生物群集構造の形成に適していることを示唆しています。 アルファ多様性指数は、すべての陽極コミュニティの多様性が異なるレベルにあることを示しました。 S1 および S2 反応器内の細菌群集は、S3 反応器の陽極バイオフィルムの細菌群集よりも低かった。

(a) 異なる陽極表面上に発達した陽極バイオフィルムの OTU、チャオ、およびシャノンを観察。 （ b ）他の作製されたアノード上に形成されたアノードバイオフィルムの希薄化曲線（S1〜S4）。 (c) PCo プロットは、バイオフィルム コミュニティ間の関係を示します。 （ d ）さまざまなエネルギー基質が豊富に含まれる電気活性バイオフィルムの共有および独自に識別された OTU のベン図。 OTU は 0.03 の距離で定義されました。

陽極バイオフィルムサンプルの希薄化曲線分析の傾きから、S3リアクター内の微生物群集の組成はS1リアクターとは大きく異なり、多様性のレベルはS3>S4>S2>S1の順序で増加することが明らかになりました（図4b）。 すべての反応器は同じ接種材料の活性汚泥で運転されましたが、電極 (S2 ～ S4) の微生物群集は、未修飾アノード (S1) の微生物群集とは著しく異なっていました。これは、実験室での主座標分析 (PCoA) から明らかです。属レベル（図4c）。 生息地におけるバイオフィルムサンプル間の微生物群集構造（種の分類）の違いに関する情報を提供するPCoプロットによるベータ多様性分析は、S3の陽極バイオフィルムの群集構造がS4に最も近いことを示しています。 このシナリオは、ベン図によって最もよく表現できます。ベン図は、4 つの別々のバイオ フィルム S1 ～ S4 内の同一かつ固有の OTU の数を計算するために適用され、サンプルの OTU 構成における類似性と重複のレベルを示しています (図 1)。 4d）。 データからは、678 個の OTU を持つ S3 が最も多く、次に 382 個の S4、101 個の S2、29 個の OTU を持つ S1 であることがわかります。 PANI 修飾アノード (S3) が細菌コミュニティの構成に顕著な影響を及ぼし、コミュニティ内の OTU の数を拡大し、独自の OTU を促進したことは注目に値します。

4 つの陽極バイオフィルムサンプルの主な門は、プロテオバクテリア (38.90% ～ 43.21%)、ファーミクテス属 (32.76% ～ 37.12%)、バクテロイデス属 (7.56% ～ 9.82%)、ユーリヤアーキオータ属 (3.85% ～ 7.59%)、および放線菌 (1.56%) でした。 -3.99%）、バイオフィルム中のそれらの相対存在量の範囲は括弧内に表示されています（図5aおよび表1）。

陽極バイオフィルム内の微生物群集の相対的な存在量は、門 (a)、クラス (b)、および属 (c) レベルで、さまざまな陽極電極 (S1 ～ S4) 上で発達しました。

クラスレベルでは、すべてのバイオフィルムサンプルにおける重要なクラスは、ガンマプロテオバクテリア (26 ～ 42%)、桿菌 (18 ～ 23)、クロストリジウム属 (3 ～ 31.2%)、バクテロイデス属 (2 ～ 12.6)、アルファプロテオバクテリア (2 ～ 9.6%) でした。 、およびベータプロテオバクテリア (0.03 ～ 4.1%)。 S3バイオフィルムでは、ガンマプロテオバクテリア、桿菌、クロストリジウム菌、およびベータプロテオバクテリアの相対存在量（％）は、それぞれ42、23、28、および4であり（図5b）、S1バイオフィルムよりも多かった。 逆に、S3 バイオフィルムではバクテロイデス菌とアルファプロテオバクテリアの割合がはるかに低かった。 属レベルでの細菌組成の相対比率を図5cに示します。 同定された流行属の上位 10 種は、エンテロバクター、シュードモナス、ラクトバチルス、クロストリジウム、パエニバチルス、ステノトロフォモナス、トラブルシエラ、オクロバクトラム、アクロモバクター、バチルスでした。 PANI でコーティングされた電極 (S3) から収集されたバイオフィルム中のエンテロバクター属の割合は、コーティングされていない電極サンプルの 14.86% から 20.92% に増加しました。

クラスター分析によるヒートマップは、陽極バイオフィルムサンプルの属レベルでの細菌群集構造の違いを視覚化するために実行されました。 図６に示すデータは、属レベルでのバイオフィルムの微生物集合体内の細菌属の変化を明らかにした。 MFC の操作後、電気活性 S3 バイオフィルムには他の陽極バイオフィルムよりも多くの種が存在することが判明しました。 結果は、調査したすべての陽極バイオフィルムで多数の起電力属が観察されたと推測します。 S3 バイオフィルムでは、エンテロバクター、シュードモナス、ラクトバチルス、クロストリジウム、パエニバチルス、ステノトロフォモナス、トラブルシエラ、オクロバクトラム、アクロモバクター、バチルスの最も高い相対存在量は、20.92、18.68、4.21、6.61、4.55、6.89、4.19、0.1でした。 8、0.94 、3.21% です。 対照的に、S1 の S1 バイオフィルムにおけるそれらの対応する最大相対存在量 (%) は、14.86、10.54、2.19、1.84、1.80、5.23、5.59、4.82、6.16、および 3.36 でした。

S1 ～ S4 バイオフィルムから収集された陽極バイオフィルムの微生物群集の代表的な属の系統発生的にクラスター化されたヒート マップ。 右上のカラーガイドによると、各パネルの色の強度は、サンプル内の属の相対存在量 (%) を表します。

図7に示すように、16S rRNA配列分析に続いて、陽極バイオフィルム内の細菌分類群の系統学的評価が行われました。これにより、多くの中温菌種の存在が明らかになり、その大部分が既知の電気原であることが明らかになりました。 系統樹に示されているように、陽極微生物バイオフィルムは、クロストリジウム、シュードモナス、エンテロバクター、ステノサーモフィルスなどのいくつかの起電性細菌が生物電気生成に関与している可能性があることを示しています。

空気陰極 MFC で使用される特有の起電力性細菌種の系統解析。 Mega-X ソフトウェアを使用して根付き系統樹を構築しました。

分類学的情報に基づいて、各陽極バイオフィルムの微生物群集の最も豊富な機能プロファイルの動態を表 2 に示します。すべての場合において、炭素と窒素の代謝に関連する微生物の機能が、化学従属栄養性、好気性、化学従属栄養性、好気性のいくつかの変化とともに確認できます。化学従属栄養性、硝化、窒素/硝酸塩/亜硝酸塩呼吸、硝酸塩/硝酸塩/亜硝酸塩脱窒。 硫黄代謝および硝酸代謝細菌のいくつかのバリエーションも、すべてのバイオフィルムにわたって観察されます。 他のアノードのバイオフィルムと比較して、S3 にはより広範囲でより強力なプロファイルの存在が検出されています。 S1、S2、および S4 と S3 の官能基の相対存在量における主な違いのいくつかを、表 2 の星印で示します。これらの違いの中で、さまざまな種類のメタン生成機能、硝酸塩の還元、および硫黄呼吸が顕著です。 。 したがって、S3 バイオフィルムは、無酸素条件下で活性汚泥水中の有機廃棄物の分解をサポートすると考えられる微生物集団の重要な機能を保存しました。 アノード内のこれらの機能プロファイルの変化と強度は、MFC で観察されるそれらの生物電気化学的性能に関連している可能性があります。

S3 アノードを備えた MFC の優れた電気的性能は、PANI と生体適合性複合植物粉末の複合効果と、グラファイト表面上で起電性バイオ フィルムの大量成長を誘発する栄養価の性質によるものであると考えられています。 注目すべきことに、裸の黒鉛材料の敵対的な性質は、その表面への細菌の定着を妨げます38,39。 さらに、複合材料中の PANI は、これらの相互作用する実体の反対の電荷による静電相互作用を通じて、活性汚泥水から細菌種をドッキングするのに役立つ可能性があります 40,41。 結果は、導電性ポリマー PANI を含む植物粉末でコーティングされたアノード (S3) が、対応する植物粉末コーティングされた rGO (rGO の導電率: 3112 S cm-1) および CNT (CNT の導電率: 106 S cm-1) よりも高い電流に寄与することを示しました。括弧内に示されているように、これら最後の 2 種類のナノ材料の導電率は非常に高いにもかかわらず、MFC に対して 107 S cm-1) まで上昇します 14,42。

MFC の現在の生産量は、約 10 日間の稼働後に最大レベルに達した後、徐々に減少しました。 このような現象の主な理由は、下に死細胞層が形成され続けることによる成熟したバイオフィルムの起電力が徐々に低下することと、バッチモードでの長時間の操作によって引き起こされる栄養制限に起因すると考えられます43。 これらのバイオフィルムの成長が構築された MFC に電力を供給するため、これらの細菌のほとんどは発電特性を備えていると我々は推測しています。 特に、電気活性微生物（EAM）は、生体電極触媒プロセスを通じて化学エネルギーを電気エネルギーに変換するために電極表面で機能する MFC の中心人物です 44。 起電性細菌種の優先的な蓄積は、起電性の挙動と剛性アノードへの電子の伝達も制御する可能性があり、慣れ親しんだアノードバイオフィルムコミュニティによって培養され、閉回路設定下で管理されます45。

バイオフィルムの SEM 視覚化を使用することにより、コーティングされたアノードの表面も同様に、細菌の活動によって放出された細胞外ポリマー物質の厚いコーティングで包まれているように見えることが示されます。 まれに、そのようなポリマー被覆層がバイオフィルムの導電性を妨げ、微生物から電極表面への電子の伝達を制限する場合があります。 対照的に、このポリマーマトリックスのプラスの特性は、細菌の凝集とアノード電極の生体適合性を促進することです。 電極表面上のポリマー被覆物質は、そこで観察可能な微生物のクラスタリング（集中した細菌群集）を促進した可能性がある。 コーティングされたアノードの優れたバイオフィルム層の発達は、SMFC の低い充電インピーダンスに貢献します46。

EAM は有機化合物または二酸化炭素 (独立栄養細菌の場合) を利用し、電子をアノードに供給します 47,48。 しかし、陽極バイオフィルム内の一部の非電気活性微生物（非 EAM）も、適切な嫌気環境と、起電力微生物の電子経路の方向を変える電子伝達メディエーターを提供することにより、MFC 性能の向上に寄与する可能性があります 6,49。 MFC から生成された電気エネルギーは、廃水処理やバイオセンサー用途など、さまざまな目的に利用されます50,51。 EAM が電極表面に蓄積し、順応し、伝播する能力は、MFC ベースの電気化学システムの性能に影響を与えます 52。

この研究により、燃料と微生物の供給源として活性汚泥を使用して動作する MFC 装置の改質黒鉛アノード上に形成された起電性バイオ フィルム内の微生物群集パターンが明らかになりました。 アルファ、ベータ、ガンマ、デルタを含むファーミクテス門とプロテオバクテリア門 53、54、55、56 およびバクテロイデス門の電気発生的性質は知られています 57。 プロテオバクテリアは陽極バイオフィルムで最も頻繁に報告されている門であり、ファーミクテス属とバクテロイデテス属がそれに続きます58,59。 しかし、分解する複雑な有機物とアルコール60,61、およびメタン生成62に関連することが知られている放線菌および真正古細菌に関する情報は、十分に理解されていない。 ガンマプロテオバクテリアはその高い電子伝達能力が報告されており 63、一方、クロストリジウム属は炭水化物から酢酸ピルビン酸と水素を生成する可能性が認められています 64。 さらに、ベータプロテオバクテリアとアルファプロテオバクテリアが MFC65 に豊富に見つかりました。 さらに、エンテロバクター（ガンマプロテオバクテリアに属する）は、一般的な外来電子属である。 すべての属の中で最も高い割合を占め、発電において重要な役割を果たしました66。 S3 バイオフィルム中のシュードモナスの相対存在量は 18.675% でした。 シュードモナス属はガンマプロテオバクテリアに属します。 グラム陰性の通性嫌気性菌は、ピオシアニン、フェナジン、および MFC パワーに寄与する関連物質などの電子伝達メディエーターを生成します 67,68,69。 クロストリジウムの相対存在量は、アノードバイオフィルム (S4) サンプルの 7.45% から、コーティングされていないアノード (S1) サンプルの 0.82% に減少しました。 間違いなく、クロストリジウム属の菌です。 は、MFC の支配的な種として徐々に認識されています 11、70、71。 ラクトバチルスの相対存在量は、コーティングされたアノード (S4) サンプルの 5.47% から、コーティングされていないアノード (S1) サンプルの 2.185% に減少しました。 乳酸菌の役割ラクトース発酵に関する研究、電気活性バイオフィルムの生成、およびメディエーターなしで廃酪水からの生物電気の発生が知られています72。

すべてのバイオフィルムには、バクテロイデスとジスゴノモナスが大量に存在していました。 ジスゴノモナスの相対存在量は、S1 の 0.01% から S2 では 5.61% に増加しました。 ジスゴノモナス (バクテロイディアに属する) の豊富さは、MFC73 の出力の増加と関連していることが判明しました。 アシネトバクターの相対存在量は、S1 の 0.03% から S3 では 1.56% に増加しました。 それらは炭水化物代謝のための発酵細菌として記載されています74。 さらに、アシネトバクターは電気活性バイオフィルム集団の重要な構成要素であると提案されています 75。 以前のいくつかの調査では、アシネトバクター属の細菌が存在することが明らかになりました。 MFC では H2 を利用するものが主流でした 76。 この結果は、MFC の陽極生体触媒としての多元的な微生物群集が、複雑な燃料源からの電力の向上に貢献しているという既存の仮説を裏付けるものです 11。 細菌の機能プロファイルと電気発生的挙動との相関関係に関する研究は限られています。 シュードモナス属などの硝酸塩還元細菌の外部起電力挙動と電流生成は、クロストリジウム属や大腸菌などの発酵細菌の嫌気性呼吸経路に関連している可能性があることが文書化されている 13,77。

これらすべてのアノードにわたるバイオフィルムにおける門、プロテオバクテリア、ファーミクテス属、およびバクテロイデス属の優勢から明らかなように、異なる導電性材料を導入することによって形成された作製されたアノード間の差異は、細菌の顕著なプロファイルを劇的に変えることはなかった。 ただし、階級と種のレベルでは変動が明確であり、後者の場合が最も高かった。 たとえば、PANI 修飾アノードは、クラス レベルではガンマプロテオバクテリア、クロストリジウム属、桿菌の相対存在量が最も高く、種レベルではシュードモナス属、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、およびビフィズス菌が最も多く存在しました。 同様に、顕著に優勢な微生物の分類クラスは、ガンマプロテオバクテリアと桿菌でした。 興味深いことに、上で議論したように、後者の 2 つのグラフェンベースの材料はより優れた導電性を有し、従来は電力を得るために使用されていたにもかかわらず、MFC はアノード上の複合粉末へのドーピング材料として rGO および CNT よりも PANI を使用した方が高い電流を生成しました。 MFC78では。

アノード電極を導電性複合材料でコーティングすることは、バイオフィルムの形成と電極触媒反応を促進するためによく行われています。 この研究により、活性汚泥を使用して動作する MFC セットアップの改質黒鉛アノード上に形成された起電性バイオ フィルム内の微生物群集パターンが明らかになりました。 異なる導電性材料を導入することによって形成された作製されたアノード間の違いは、クラスおよび種レベルでの細菌の顕著な構造プロファイルを劇的に変化させ、後者の場合の変動はより大きかった。 コーティング材料の選択は微生物の多様性に大きな影響を与えましたが、MFC-S3 から収集されたバイオフィルムでは他の材料よりも実質的に高い OTU レベルが観察されました。 たとえば、PANI 修飾アノードは、クラス レベルではガンマプロテオバクテリア、クロストリジウム属、桿菌の相対存在量が最も高く、種レベルではシュードモナス属、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、およびビフィズス菌が最も多く存在しました。 これらの結果は、陽極バイオフィルムの細菌群集構造が、グラファイト電極上の導電性材料を変更することによって大幅に変更できることを示した。 興味深いことに、MFC は、アノード上の複合粉末へのドーピング材料として rGO や CNT よりも PANI を使用した方が高い電流を生成しました。 この研究は、細胞と電極間の相互作用とアノード上のバイオフィルムの成長ダイナミクスについての洞察を提供し、実用化に向けた MFC 技術の開発に大きな刺激を与えます。

この研究で使用された生データは、Bioproject Accession Number PRJNA801836 で NCBI Sequence Read Archive (SRA) にアップロードされました。

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バハー博士とスナンダンは、インドのグワーハーティー工科大学中央計器施設とエジプトの国立研究センターがこの研究を支援していることに感謝したいと思います。

この研究は、バイオテクノロジー省世界科学アカデミー (DBT-TWAS) (プロジェクト番号: BSBEPDxDBT00389BAM001/19-1436 to BAH) および DBT インド (助成金番号 BT/PR41449/NER/95/1687/2020) によって後援されました。 PGに）。

水質汚染研究部、環境研究および気候変動研究所、国立研究センター、33 El-Bohouth St.、Dokki、12622、ギザ、エジプト

イースト A. ヘムダン & ガミラ E. エルタウィール

生物科学および生物工学部、インド工科大学グワーハーティー校、グワーハーティー、781039、インド

バハー・A・ヘムダン、スナンダン・ナハ、プラナブ・ゴスワミ

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BAH と PG が研究を考案し、設計しました。 BAH と SN は実験を実施し、データを収集しました。 GEE と BAH は微生物学的データを分析および解釈しました。 BAH が草稿を書きました。 PG は原稿をレビューし、編集しました。 著者全員が原稿を読んで承認しました。

東部 A. ヘムダンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Hemdan, BA、El-Taweel, GE、Naha, S. 他微生物燃料電池の改質黒鉛アノード上に発達した起電性バイオフィルムの細菌群集構造。 Sci Rep 13、1255 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-27795-x

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受信日: 2022 年 9 月 29 日

受理日: 2023 年 1 月 9 日

公開日: 2023 年 1 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27795-x

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