ウリカーゼ紙一体型電極を使用した、希釈されていない人間の唾液中の尿酸の電気化学的検出

Scientific Reports volume 12、記事番号: 12033 (2022) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

この研究では、唾液中の尿酸 (UA) を検出するためのウリカーゼ固定化紙 (UOx 紙) 統合電気化学センサーを紹介します。 UOx は、ワックスパターンの紙基材の検出ゾーンに固定化されました。 この UOx 紙は、o-フェニレンジアミンの電解重合後、プルシアンブルーで修飾されたスクリーン印刷された炭素電極と一体化され、少量 (20 μL) のサンプル用の電気化学セルを構築しました。 まず、UOx紙の製造条件を最適化しました。 次に、UOx 紙ベースの電気化学 UA センサーの電流測定応答を、人工唾液中の既知濃度の UA 標準溶液を使用し、-0.1 V (対 Ag 擬似参照電極) の印加電位で分析しました。 UOx 紙ベースの電気化学 UA センサーは、50 ～ 1000 μM (R2 = 0.998) の線形範囲で 4.9 μA・mM−1 の感度、高い選択性と良好な再現性、および 18.7 μM の検出限界を示しました ( 0.31 mg/dL) UA。 最後に、健康な対照者 (n = 20) と痛風患者 (n = 8) の未希釈の唾液サンプル中の UA レベルを定量しました。 このレベルは、従来の唾液 UA 酵素アッセイで測定された値および血清 UA レベルと相関していました。 UOx 紙ベースの電気化学 UA センサーは、唾液中の UA レベルを評価するための使いやすく便利なツールです。

人体内のプリン代謝の最終生成物である尿酸 (UA) は、痛風を含むさまざまな生理学的および病理学的状態において重要な役割を果たしています1、2、3。 UA は抗酸化物質であり、低尿酸血症は多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病などの免疫介在性または変性神経疾患と関連していることが報告されています 3。 再発性アフタ性口内炎および口腔扁平苔癬も、唾液中の UA レベルの低下と関連していました 4,5。 しかし、高尿酸血症は、痛風、メタボリックシンドローム、慢性腎臓病、心血管疾患の発症と進行に寄与します3。 高尿酸血症は必ずしも痛風を誘発するわけではなく、痛風の診断は高尿酸血症のみに基づいているわけではありませんが、組織内に尿酸一ナトリウムの結晶が沈着する高尿酸血症の被験者では痛風が発症します。 痛風の管理に関する最近のガイドラインでは、血清 UA レベルが 5 ～ 6 mg/dL 未満であるが、3 mg/dL 未満ではないことを達成および維持するように尿酸降下療法を最適化することが推奨されています6,7。 したがって、高尿酸血症や痛風の診断、治療、経過観察には血清UAのモニタリングが不可欠です。 しかし、静脈穿刺は侵襲的であり、怪我や出血などの合併症を引き起こす可能性があります。 さらに、血清 UA の分析には、特殊な機器を使用した実験室環境が必要です。

唾液診断は、唾液が体の生理学的および病理学的状態を反映するため、治療後の転帰を予測するだけでなく、ポイントオブケア検査（POCT）を利用する分野や病気を頻繁かつ簡単にモニタリングするための臨床応用でも注目を集めています8。 、９． UAは主に肝臓と腸で生成されます。 ほとんどの UA は、尿酸トランスポーターを介して腎臓と腸から排出されます。 ただし、有機アニオンおよび尿酸トランスポーターも唾液腺で発現されます10。 さらに、いくつかの臨床研究では、ほとんどの場合、血清と唾液の UA レベルの間に直線関係があることが報告されており、血液検査の代替として唾液の UA 測定の可能性が示唆されています 1,2,11,12。 唾液 UA の検出には、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)13、キャピラリー電気泳動 (CE)14、酵素比色アッセイキット 15、16、17、18 などのさまざまな分析方法が開発されています。 ただし、通常は時間がかかり、高価な機器や専門家が必要なため、日常的な個人使用には適していません。 一部の市販の酵素アッセイキットは、唾液、血清、尿などのさまざまな種類の生体マトリックスに使用できます2が、生体サンプル中に存在するビタミン C、脂質、内因性ペルオキシダーゼなどの他の干渉の影響を受ける可能性があり、最終的には誤った結果を引き起こす2、19、20、21、22。 さらに、試薬内のペルオキシダーゼはアジ化ナトリウムなどの防腐剤と互換性がないため、使用期限が短くなります23。 その結果、試薬の期限が過ぎると感度が低下する可能性があります2,24。

電気化学センサーは、唾液 UA を検出するための高感度、迅速な応答時間、携帯性、低コスト、操作の容易さなどの実用的な利点により、大きな注目を集めました 25,26,27。 キムら。 は、統合された無線電子機器を備えたウリカーゼ修飾スクリーン印刷電極 (SPE) システムを使用したウェアラブル唾液 UA マウスガード バイオセンサーを報告しました 28。 このマウスガード バイオセンサーは、唾液中の UA レベルをリアルタイムで継続的に監視できる可能性がありますが、不快感や電子機器の生体適合性の問題により、その使用は制限されています。 黄ら。 は、唾液 UA 分析のための紙ベースの電気分析装置を報告しました 29。 彼らは、酸化インジウムスズ（ITO）基板上にポリ（3,4-エチレンジオキシチオフェン）と酸化グラフェンの複合材料を作用電極として作製し、作製した電極を紙で覆って薄層電気化学セルを構築した。 このデバイスは高い感度を示しましたが、別個の参照電極と対電極が必要なため、使用が不便でした。 したがって、UA 関連疾患の POCT のための唾液 UA の分析には、簡単、迅速、費用効果が高く、感度の高い方法が必要です。

この研究では、ウリカーゼ (UOx) 固定化紙 (UOx 紙) とプルシアン ブルー (PrB) 修飾スクリーン印刷炭素電極 (PrB-SPCE) に基づいて、簡単で効果的な電気化学 UA センサーを作製しました。 電極の選択性と耐生物汚染性を向上させるために、o-フェニレンジアミン (o-PD) を PrB-SPCE 上で電解重合させました (PPD/PrB-SPCE)。 単一円のワックスパターンのレンズクリーニングティッシュを使用する UOx ペーパーを PPD/PrB-SPCE と統合して、少量サンプル用の電気化学セルを構築しました。 まず、紙上に UOx を固定化するための作製条件を最適化しました。 次に、人工唾液中での感度、選択性、再現性、安定性に基づいて、UOx 紙一体型電気化学 UA センサーの分析性能を評価しました。 最後に、非痛風対照（n = 20）および痛風患者（n = 8）から採取した未希釈の唾液サンプル中の UA 濃度を測定し、血清 UA レベルと測定値を比較することで、UOx 紙一体型電気化学 UA センサーを評価しました。従来の Salimetrics® 唾液 UA 酵素アッセイ キットを使用します。 唾液 UA を検出するための UOx 紙一体型電気化学センサーを図 1 に概略的に示します。

UOx 紙ベースの電気化学 UA センサーの感知原理と結果として生じる電流信号、およびヒトの唾液サンプル中の尿酸濃度 (mg/dL) の概略図。

UA (≥ 99.0%)、UOx (4 単位/mg のカンジダ属)、o-PD、硫酸ナトリウム (Na2SO4)、塩化ナトリウム (NaCl)、塩化カルシウム (CaCl2)、塩化カリウム (KCl)、クエン酸、チオシアン酸カリウム（KSCN）、塩化アンモニウム（NH4Cl）、リン酸一カリウム（KH2PO4）、リン酸二カリウム（K2HPO4）、L-乳酸（LA）、D-グルコース（Glu）、L-アスコルビン酸（AA）、アセトアミノフェン(AP)、ウシ血清アルブミン (BSA) およびグルタルアルデヒド (GA) 溶液は、Sigma Aldrich (セントルイス、ミズーリ州、米国) から購入しました。 Whatman レンズ クリーニング ティッシュ (グレード 105) は、GE Healthcare Life Sciences (米国ペンシルバニア州ピッツバーグ) に注文されました。 すべての試薬は分析グレードであり、さらに精製せずに使用しました。 すべての水溶液は、抵抗率 18.2 MΩ・cm の脱イオン水 (DW) を使用して新たに調製されました。

ワックスパターン紙は、XeroxColorQube 8570 N プリンター (富士ゼロックス、東京、日本) とパターン設計用の AutoCAD ソフトウェア (Autodesk、サンラファエル、カリフォルニア州、米国) および BF-150C 乾燥オーブン (DAIHAN Scientific、ソウル、日本) を使用して準備されました。韓国）ワックス含浸用。 サイクリックボルタンメトリーおよびクロノアンペロメトリー (CA) を含むすべての電気化学実験は、Compactstat (Ivium Technology、アイントホーフェン、オランダ) を使用して室温 (RT) で実行されました。 PrB 修飾カーボン作用電極 (直径 4 mm)、カーボン対電極、および Ag 擬似参照電極を含む PrB-SPCE は、DropSens (DRP-710、Llanera、アストゥリアス、スペイン) から購入しました。

疎水性ワックスバリアを備えたレンズ洗浄用ティッシュは、電極 1 つあたり幅 11 mm、長さ 15 mm でした。 親水性ゾーンの直径は 8 mm でした (補足情報 (SI) の図 S1[A])。 紙へのワックスの均一な含浸は、BF-150C 乾燥オーブン内で 80 °C で 120 秒間実行されました。 最後に、ワックスパターン紙をオーブンから取り出し、室温まで急速に冷却しました。

レンズ洗浄組織内に UOx を固定化するために、30 単位の UOx (37.5 mg/mL) を、200 μL のリン酸カリウム緩衝液 (PB、0.1 M、pH 7.0) 中の 2 mg の BSA および 1 μL の 8% グルタルアルデヒド溶液と混合しました。 、SIの図S1(B)に示すように。 次に、混合溶液10μLをワックスパターン紙上に滴下し、クリーンルーム(23.5±1.0℃、25.0±5.0%)で40分間乾燥させた。 未結合の酵素を除去するために、この紙を0.1 M PBで洗浄しました。 最後に、UOx 紙をクリーン ルーム (23.5 ± 1.0 °C、25.0 ± 5.0%) で 30 分間乾燥させました。

UA センサーの製造前に、KCl 溶液中での電位範囲 - 0.1 ～ 0.4 V (対 Ag 擬似参照電極)、スキャン速度 50 mV/ のサイクリック ボルタンメトリーによって PrB-SPCE の電気化学的特性を確認しました。 s. 次に、ポリ(o-PD) (PPD) を、10 のmM o-PD と 5 mM 硫酸ナトリウムにより、唾液成分による生物付着と干渉を最小限に抑えます28。 次に、パンチ穴（直径 8 mm）を備えた両面接着テープの一部を電極に貼り付けました。 最後に、サンプル溶液を保存するとともに、電気化学的検出のために 3 電極システムを電気的に接続するために、テープを UOx 固定化紙で覆いました。

CA技術を使用して、UOx-paper/PPD/PrB-SPCEのUA検出感度を評価しました。 UA の標準溶液は、DW28 中の 5 mM NaCl、1 mM CaCl2、15 mM KCl、1 mM クエン酸、1.1 mM KSCN、および 4 mM NH4Cl からなる人工唾液で調製されました。 人工唾液のpHは6.7に調整した。 標準溶液中での 1 分間のインキュベーション後、-0.1 V (対 Ag 擬似参照電極) の印加電位で 60 秒間の CA 技術を使用して、さまざまな濃度の UA を検出しました。 検量線は、人工唾液中の 50 ～ 1000 μM の濃度範囲で 20 μL の UA における CA 測定から得られました。

この研究とサンプル収集はソウル大学盆唐病院倫理委員会 (IRB No. B-1911-577-303) によって承認され、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。 痛風男性患者8名（年齢（平均値±平均値の標準誤差（SEM））、39.1±3.0歳）と非痛風男性20名（年齢40.8±6.4歳）を登録した。 血清および唾液サンプルは絶食条件下で同時に収集されました。 さらに、尿酸降下療法（フェブキソスタット（n = 4）、アロプリノール（n = 3）、またはベンズブロマロン（n = 1））の開始前後の痛風患者から 16 個のペアサンプルを入手しました。 治療期間は2.9±1.1ヶ月でした。 刺激を受けていない全唾液サンプルを、プラスチックチューブに受動的に垂らすことによって収集しました。 静脈血サンプルを遠心分離し(1500×g、室温で15分間)、血清を得た。 全唾液サンプルを 4,500 xg、4 °C で 10 分間遠心分離しました。 すべてのサンプルは分析まで -80 °C で凍結されました。 血清 UA レベルは、市販の酵素比色アッセイ キット (Beckman Coulter Inc.、米国カリフォルニア州ブレア) を製造者の指示に従って使用して測定しました。 唾液 UA 分析では、まず 20 μL の未希釈の唾液サンプルを UOx ペーパー/PPD/PrB-SPCE 上に滴下しました。 60 秒間のインキュベーション後、-0.1 V (対 Ag 擬似参照電極) で 60 秒間 CA 測定を実行しました。 唾液サンプル中の UA 濃度は検量線の傾きから計算されました。 さらに、唾液 UA 酵素アッセイ キット (Salimetrics LLC、米国ペンシルバニア州フィラデルフィア) を製造者の指示に従って使用して、唾液 UA レベルを測定しました。

連続変数は平均値 ± SEM として表示されます。 2 つのグループの比較には、独立したサンプルの t 検定を使用しました。 対応のある t 検定を使用して、尿酸降下療法の前後の UA レベルを比較しました。 一元配置分散分析を使用して 3 つのグループにわたる UA レベルを比較し、フィッシャーの直接確率検定を実行してカテゴリデータを分析しました。 ピアソンの相関係数を計算して、血清と唾液の UA レベルの間、または準備された UA センサーと従来の方法で測定された唾液の UA レベルの間の関係を分析しました。 統計的有意性として、p 値 0.05 が考慮されました。 統計分析は、IBM® SPSS Statistics バージョン 25 (IBM Corporation、米国ニューヨーク州アーモンク) を使用して実行されました。

通常、UA バイオセンサーは、UA に対して高い特異性を持つ UOx などの酵素を利用しています。 ただし、UA の UOx ベースの電流検出では、一般に過酸化水素 (H2O2) 生成物を測定するために比較的高い電位 (> + 0.65 V) が必要なため、さまざまな電気活性干渉の影響を受けます。 PrB またはヘキサシアノ鉄酸第二鉄は、電子輸送を強化し、低い過電圧で H2O2 の還元を触媒できるため、「人工ペルオキシダーゼ」と呼ばれています 30,31。 したがって、PrB-SPCE は、UA の酵素反応によって生成される H2O2 を選択的に陰極検出します。 ただし、PrB は中性または弱アルカリ性の溶液中で分解する可能性があります 32。 さらに、唾液は、他の電気活性種と同様に、粘度が高く、タンパク質が集合しているため、管理が複雑で困難なマトリックスです 33。 PrB-SPCE の安定性、選択性、生体適合性を向上させるために、電解重合により PrB-SPCE 上に PPD などの外部保護高分子膜を導入しました。 PPD 膜は、H2O2 などの低分子量化合物を透過し、AA や AP などの他の電気活性種を排除し、電極上の生物付着を防ぐ能力で知られています 28,34。 H2O2 に対する PPD/PrB-SPCE の電極触媒特性を特徴付けるために、1 mM H2O2 の存在下および非存在下で人工唾液中で、-0.20 ～ +0.40 V (対 Ag 疑似参照電極) の電位範囲でサイクリック ボルタンメトリー測定を実行しました。スキャン速度は50 mV/秒。 図2aに示すように、PPD/PrB-SPCEは、人工唾液溶液中で特徴的なプルシアンホワイト（PrW）/PrB酸化還元活性（0.02/0.13V）を示しました。 陰極ピーク電流は、1 mM H2O2 溶液中で - 0.00 V で - 12.3 μA まで増加しました。 H2O2 に対する PPD/PrB-SPCE の電気化学的性能を確認するために、-0.1 V (対 Ag 擬似参照電極) の印加電位で CA 技術を使用しました。 PPD/PrB-SPCE の選択性は、UA、AA、AP などの唾液の関連電気活性成分の生理学的レベルの存在下での H2O2 の電流応答によって確認されました。 図2bおよび2cに示すように、H2O2（50、100、および200μM）による強い応答と比較して、UA（1000μM）、AA（500μM）、およびAP（500μM）による干渉電流は無視できる程度でした。 μM）。 特に、PPD/PrB-SPCE 上の AA (- 0.12 ± 0.02 μA、[平均 ± 標準偏差]) および AP (- 0.06 ± 0.002 μA) の電流応答は、PrB-SPCE 上の電流応答 (- 0.17 ±それぞれ、AA の場合は 0.01 μA、AP の場合は - 0.14 ± 0.01 μA)。 ただし、PPD/PrB-SPCE および PrB-SPCE (-0.38 ± 0.01 μA) での H2O2 のカソード電流 (- 0.35 μA ± 0.01 μA) は同様でした。 この結果は、PPD/PrB-SPCE が、唾液中の電気活性種の可能性による干渉効果なしに H2O2 の検出に対して高い選択性を持っていることを示しています。 さらに、外部 PPD 膜は PrB-SPCE への H2O2 の透過性を阻害しませんでした。

（ a ）1.0 mM H2O2を含むおよび含まない人工唾液溶液中のPPD / PrB-SPCEのサイクリックボルタモグラム、電位範囲は-0.2〜0.4 V（対Ag疑似参照電極）、スキャン速度は50 mV /秒です。 。 (b) 1000 μM UA、500 μM AA、および 500 μM AP を含む一般的な電気活性干渉に対する応答と比較した、PPD/PrB-SPCE の 0、50、100、および 200 μM H2O2 に対する電流応答。 （ c ）-0.1 Vでの、それぞれ50μM H2O2と1000μM UA、および500μM AA、および500μM APに対するPPD / PrB-SPCEとPrB-SPCEの電気化学的応答の比較（対Ag擬似参照）電極）。 1000 μM UA の分析に対する (d) UOx 濃度、(e) UOx 混合物の滴下量、および (f) UOx 固定化方法の影響。 エラーバーは平均値の標準偏差を表します (n = 3)。

紙ベースの分析プラットフォームには、低コスト、簡単な製造などのいくつかの利点があり、生化学センサーや分析センサーなどの多くの用途で使いやすい35。 さらに、非毒性の試薬を使用したワックス印刷により、紙を目的のパターンに従って簡単にデザインできます。 UA検出のための生物分析ツールとして紙を使用するために、SPCEの3電極システムに統合された単一ゾーンを設計しました。 次に、サンプル吸収領域およびサンプル内の UOx と UA 間の反応を促進する電気化学セルとして使用するために、ワックス パターンのレンズ ペーパーの親水性ゾーン内に UOx を固定化しました。 したがって、紙上に UOx を効率的に固定化するには、紙の種類、UOx 濃度、UOx 混合物の量などの実験条件を最適化する必要がありました。

まず、ワットマンNo.1、No.114、レンズクリーニングティッシュNo.105などの紙の種類をUOxの固定化に最適化しました。 紙の種類により孔径や厚さが異なるため（表 S1）、紙面上の溶液流速や材質の均一性の違いにより検出結果は異なります36。 したがって、紙ベースのバイオセンサーの電流信号を改善するには、適切な紙の選択が重要であると考えられます。 紙の種類の影響は、-0.1 V (対 Ag 擬似参照電極) での 1000 μM UA に対する UOx 紙/PPD/PrB-SPCE の陰極電流応答に従って調査されました。 図S1(C)に示すように、UA電流は、最も薄く、最も広い孔を有するレンズ洗浄用組織で最も高かった。 UOx 紙/PPD/PrB-SPCE の電気化学的応答を強化するために、UOx 濃度と UOx 混合物の滴下量を最適化しました。 図2dは、UOxの濃度（0、12.5、25、37.5、50、および62.5 mg/mL）。 UA 電流は、UOx 濃度が 12.5 mg/mL から 37.5 mg/mL に増加するにつれて増加しました。 UOx の濃度がさらに増加すると、UOx/PPD/PrB-SPCE のカソード電流は減少しました。 さらに、UOx濃度が37.5 mg/mLに固定された場合、UOx混合物の最適滴下量は10μLであることがわかりました（図2e））。 UOx 混合物の滴下量が増加すると、電流信号が減少しました。

GA は、タンパク質の分子間架橋に最も広く使用されている二官能性試薬の 1 つであり、架橋剤のアルデヒドとタンパク質のアミン間の反応により共有結合を形成します 37,38。 しかし、酵素が GA に直接架橋結合すると、活性が失われる傾向があります。 したがって、BSA などのアミノ基が豊富なフィーダーを使用して GA と穏やかに架橋すると、酵素の内部アミノ基の化学修飾が減少し、酵素の安定性が向上します 39。 さらに、フィルムの多孔性を低減できるため、フィルムの応答性が向上します40。 その結果、架橋剤および安定剤としてGAおよびBSAを使用して調製されたUOx紙は、UOxのみを使用して調製された紙（-4.03±0.14μA）よりも高い電流（-5.04±0.35μA）を生成しました（図2f）。 挿入図は、酢酸セルロースおよびニトロセルロース膜上のタンパク質の検出に一般に使用されるポンソー S を使用した UOx 紙の染色画像を示しています 41。 UOx 紙上のタンパク質は Ponceau S 色素で赤く染まりました。 電流信号と UOx 紙の染色画像に基づいて、UOx が紙上に正常に固定化されていることを確認しました。 さらなる実験では、レンズ洗浄ティッシュ No. 105 上で 37.5 mg/mL UOx および BSA および GA との UOx 混合物 10 μL の最適条件を使用しました。

CA技術を使用したUA検出のためのUOx-paper/PPD/PrB-SPCEの分析性能を調査しました。 さまざまな濃度の UA (01000 μM) を含む 20 μL の人工唾液溶液中の UOx 紙/PPD/PrB-SPCE の電流応答を、-0.1 V (対 Ag 擬似参照電極) の印加電位で測定しました。 図3aに示すように、UOx紙/PPD/PrB-SPCEの陰極電流は、UA濃度の増加とともに増加しました。 UOx ペーパー/PPD/PrB-SPCE の応答は、1000 μM までの UA 濃度に対して線形でした (R2 = 0.998)。ブランクの標準偏差とスロープ法による検出限界は 13.3 μM でした ( 3 sbl/スロープ）42、検出感度は5.0 μA・mM-1（39.8 μA・mM-1・cm-2）です。 しかし、GA と BSA を用いて UOx を PPD/PrB-SPCE 上に直接固定化した UOx-membrane/PPD/PrB-SPCE の電流応答は、UOx-paper/PPD/PrB-SPCE よりも小さかった。 その結果、UOx-ペーパー/PPD/PrB-SPCEの検量線の傾きは、UOx-メンブレン/PPD/PrB-SPCEの検量線の傾き(1.7μA・mM-1)より約3倍高かった。 表 1 は、唾液 UA の検出における当社の UOx ペーパー/PPD/PrB-SPCE のセンシング性能と他の UOx ベースの SPCE のセンシング性能の比較を示しています。 当社の UA センサーのパフォーマンスは、サンプル量が少なく、直線範囲が広く、感度も中程度であるという点で良好でした。 特に、その検出範囲には、健康な対照者から痛風患者まで、唾液中の UA のすべての濃度が含まれていました。

(a) - 0.1 V での UOx 紙/PPD/PrB-SPCE と UOx 膜/PPD/PrB-SPCE の比較におけるカソード電流対 UA 濃度の検量線 (対 Ag 擬似参照電極) 、 それぞれ。 （ b ）-0.1 VでのUOx紙/PPD/PrB-SPCEの500μM UAに対する電流応答（対Ag疑似参照電極）を、800μMグルコース、200μM AA、 100 μM AP および 1000 μM LA。 （ c ）-0.1 V（対Ag擬似参照電極）での人工唾液中の500μM UAに対する電流応答に基づいた、異なる製造日でのUOx紙/PPD/PrB-SPCEの再現性。 （ d ）4℃で28日間保存した500μM UAに対する電流応答に基づくUOx紙/PPD/PrB-SPCEの安定性。 エラーバーは平均値の標準偏差を表します (n = 3)。

UOx ペーパー/PPD/PrB-SPCE の選択性を評価するために、500 μM UA の電流応答を、800 μM Glu、200 μM AA、100 μM AP、1000 μM LA などの他の潜在的な干渉物質の電流応答と比較しました。 図3bに示すように、UAのみが電流の劇的な変化を引き起こしましたが、Glu、AA、AP、およびLAによって引き起こされる干渉電流は無視できました。 この結果は、UOx 紙/PPD/PrB-SPCE が干渉物質に関連する影響を及ぼさずに UA の検出に対して高い選択性を持っていることを示しました。 干渉物質に加えて、非特異的な生体分子や微生物の吸着は、体液にさらされる界面にとって永続的かつ広範な脅威であり、その後、バイオセンサーの機能が部分的または完全に損なわれる可能性があります43。 PPD は、おそらくその非常にコンパクトなため、タンパク質性媒体中で抗生物付着特性を持つことが知られています 44,45。 人工唾液と本物の唾液サンプルを使用して、UOx-paper/PPD/PrB-SPCE の抗生物付着能力をテストしました。 図S2に示すように、本物の唾液にスパイクされたUA（300μM）に対するUOx紙/PPD/PrB-SPCEの電流応答は、人工唾液の86％および92％に保持されました。 しかし、PPD を含まない UOx 紙/PrB-SPCE は、人工唾液と比較して本物の唾液で現在の反応の 63% と 68% を示しました。 したがって、PPD は電極表面へのタンパク質の非特異的付着を最小限に抑えるのに有効であるのではないかと考えました。

さらに、異なる製造日に 10 個のセンサーを使用して UA (500 μM) に対する電流応答を測定することにより、UOx 紙/PPD/PrB-SPCE の再現性を調査しました。 UA センサーの変動係数 (CV) は 4.8% (図 3c) であったため、UOx-paper/PPD/PrB-SPCE は高い再現性を示しました。 安定性は、4 °C での 28 日間の保存中の 500 μM UA に対する UOx ペーパー/PPD/PrB-SPCE の電流応答を評価することによってテストされました。 図3dに示すように、28日間で電流に大きな変化はありませんでした（初期応答の約97％）。これは、UOx紙/PPD/PrB-SPCEの安定性を示唆しています。

唾液は、非侵襲的な採取、使いやすいサンプル、安価な保管など多くの利点があるため、患者の臨床診断と管理に使用される体液です48。 しかし、その日常的な使用は、分析物のさらなる希釈、食物による干渉、または歯周または唾液腺の健康状態によって制限されます。 特に、唾液中の多くの成分が対象分析物の応答に影響を与える可能性があるため、唾液は生物学的分析にとって困難かつ複雑なマトリックスです49。 したがって、唾液中の UA を検出するには、高感度かつ選択的な方法が必要です。

POCT に対する当社の UA センサーの実現可能性を評価するために、非痛風対照 (n = 20) と痛風患者 (n = 8) の唾液中の UA 濃度を測定しました。 さらに、痛風患者の場合、尿酸降下療法の前後で唾液中のUAレベルを測定しました。 結果は、参照値としての血清 UA レベルとともに、市販の唾液 UA 酵素アッセイ (Salimetrics®) の結果と比較されました。

まず、痛風患者の血清 UA レベル（10.23 ± 0.36 mg/dL、平均 ± SEM）は、非痛風対照（6.20 ± 0.22 mg/dL、p = 8.77 × 10−10、図 4a）よりも有意に高かった。 。 高尿酸血症（血清 UA ≥ 7.0 mg/dL として定義）は、対照群よりも痛風群で有意に蔓延していました（100% 対 20%、p = 1.59 × 10−10）。 尿酸降下療法により、痛風患者 3/8 (37.5%) の血清 UA が 6.0 mg/dL 未満の濃度まで減少しました。

血清および刺激されていない全唾液サンプル中の尿酸 (UA) レベル。 (a) 痛風患者 (n = 8) は、対照被験者 (n = 20、すべて p < 0.05) よりも有意に高いレベルの血清または唾液 UA を示しました。 当社の UA センサーで測定した唾液 UA レベルは、対照症例と痛風症例の両方において、従来の酵素比色アッセイで測定した血清および唾液 UA レベルよりも有意に低かった (両方とも ANOVA による p < 0.0001)。 エラーバーは平均値の標準誤差を表します。 (b) 血清または唾液中の UA レベル (Salimetrics® および UA センサーで測定) は、互いに有意な正の相関関係がありました。

次に、Salimetrics®アッセイに基づくと、唾液中のUAレベルは対照群で2.34±0.25mg/dL、痛風群で7.51±1.09mg/dLでした（p=0.002、図4a）。 唾液中のUAレベルは、対照の血清では37.7%低く、痛風患者の血清では73.4%低かった。 作製された UA センサーの場合、唾液 UA レベルは対照群で 1.05 ± 0.15 mg/dL、痛風群で 3.54 ± 0.81 mg/dL でした（p = 0.018、図 4a）。 これらの唾液レベルは、痛風群と対照群の血清 UA レベルのそれぞれ 34.6% と 16.9% に相当しました。 どちらの方法でも、唾液中の UA レベルは対照群よりも痛風群の方が有意に高かったが、血清 UA レベルよりは有意に低かった。 結果は以前の研究 11、12、13、14 の結果と一致しました。 しかし、Salimetrics® アッセイに基づく唾液 UA レベルは、すべての被験者を含む調製済み UA センサーで得られた値よりも有意に高く (p = 5.26 × 10−13)、特に UA センサーによる 2 mg/dL 未満の低濃​​度範囲で高かった。 (図4b)。 2 つの方法間の唾液 UA レベルのこの違いは、内因性化合物による干渉とともに、低濃度の UA に対する酵素検査キットの大きな変動に起因すると考えられます。 また、それは、準備された UA センサー内でのシグナル分子の拡散の減少によってもたらされる可能性があります。 まず、Salimetrics® アッセイでは、赤色色原体の生成による UA の検出を可能にする酵素反応混合物を利用します。 UOx は UA を酸化してアラントインと H2O2 にします。 次に、H2O2 はペルオキシダーゼによる 2 番目の酵素反応で使用され、色原体が形成され、波長 515 (または 520) nm で定量的に測定されます。 この酵素アッセイは簡単で市販されていますが、H2O2 のペルオキシダーゼ触媒反応による色原体形成は、生物学的マトリックス中の内因性交絡成分による干渉を受けやすく、最終的には偽陽性または偽陰性の結果を引き起こす可能性があります 19、20、21、22。 Salimetrics® アッセイでは、唾液サンプルからムチンやその他の干渉物質を除去するために遠心分離が必要ですが、干渉物質として作用する可能性のある複数の化合物を完全に除去することはできません。 次に、メーカーの指示に従って、同じキット内の UA 標準 (5 mg/dL) と対照 (高および低) を使用して、日間の精度を評価しました。 表 S2 に示すように、UA 濃度の計算に使用された UA 標準の CV は 8.8% であり、対照高 (8.6 mg/dL と推定される) は 5% 未満の CV を示しました。 しかし、対照低 (2.5 mg/dL と推定) の CV は 36% にも上りました (表 S2)。 この結果は、低濃度の UA に対する感受性が比較的低いことに起因すると考えられます。 そして、それは、いくつかの研究で言及されている、試験結果の大きな偏差やキット間のばらつきなど、酵素アッセイのいくつかの制限を引き起こす可能性があります2、19、24、50。 反対に、UA センサーの CV は、1.7 ～ 5 mg/dL の低濃度範囲ではすべて 5% 未満でした (表 S3)。 そして、作製したペルオキシダーゼを使用しないUAセンサー、UOx-paper/PPD/PrB-SPCEは、唾液中の複数の成分による干渉を最小限に抑えるために、UOxペーパーとPPDの2種類の膜で作製されました。 しかし、これらの保護層は信号分子の拡散を減少させ、その結果 UA レベルが低下する可能性があります。 しかし、対照群で測定された唾液中の UA レベルは、HPLC-UV または電気化学的方法で分析された以前の研究と一致しています 14、29、50。 さらに、UA センサーを使用した痛風グループの平均唾液 UA レベルは、対照グループよりも 3.37 倍高く、これは Salimetrics® アッセイの 3.21 倍と同様でした。 2 つの方法で測定された血清および唾液中の UA レベルは、互いに有意な相関がありました (ピアソン相関係数は 0.631 ～ 0.788 の範囲でした、図 4b)。

図5aに示すように、尿酸降下療法は、痛風グループの血清UAレベルを10.23±0.36mg/dLから7.84±0.84mg/dLに有意に減少させた(p=0.015)。 唾液中の UA レベルは、Salimetrics® アッセイでは 7.51 ± 1.09 から 5.78 ± 0.90 mg/dL に、UA センサーでは 3.54 ± 0.81 から 2.75 ± 0.95 mg/dL に減少する傾向がありましたが、統計的有意性は観察されませんでした。 図5bに示すように、Salimetrics®アッセイを使用した場合、唾液尿酸レベルの変化は血清UAレベルの変化と相関しませんでした。 それにもかかわらず、我々の UA センサーは、唾液中の UA レベルの変化が血清 UA レベルの変化と有意に相関していることを明らかにしました (ピアソン相関係数 = 0.982)。 これは、UA センサーの干渉が減少し、UA の濃度が低い場合でも、唾液中の UA が正確に検出されることに起因すると考えられます。 その結果、提案した UA センサーは唾液 UA の測定において信頼性が高いことがわかりました。 当社の UA センサー、UOx-paper/PPD/PrB-SPCE の利点は次のとおりです。(1) 希釈されていないヒトの唾液中の UA に対する感度と特異性。 （２）少量（２０μＬ）の唾液サンプル中のＵＡの検出。 (3) UA の迅速な検出 (わずか 2 分以内) (インキュベーション 1 分 + 検出 1 分)、および使いやすさ。 したがって、作製された UA センサーは、血清 UA レベルを反映できる唾液 UA レベルを測定するためのシンプル、高速、信頼性の高いツールとして利用できます。

尿酸降下療法後の血清および刺激されていない全唾液サンプル中の尿酸 (UA) レベルの変化。 (a) 痛風患者 (n = 8) では、治療後に血清 UA レベルが大幅に減少しました。 ただし、唾液中の UA レベルは、使用された方法に関係なく、大幅に変化しませんでした。 (b) 血清 UA の変化は、当社の UA センサーで測定した唾液 UA レベルの変化と有意な相関がありましたが (p < 0.0001)、Salimetrics® アッセイでは相関しませんでした。

要約すると、PPD/PrB-SPCEと統合されたUOx紙を使用した、シンプルで信頼性の高い電気化学UAセンサーを紹介しました。 UOx 紙は、UOx と UA 間の反応のためのサンプル吸収領域として機能するだけでなく、唾液内の干渉を防ぐフィルターとしても機能します。 PPD は電極の選択性と生物付着防止性を向上させます。 その結果、調製された UOx ペーパー/PPD/PrB-SPCE は、広い線形範囲、高い選択性、良好な再現性を備えた UA に対する堅牢な感度を示し、必要なサンプル量が少なくて済みました。 この UA センサーを使用して、希釈および刺激されていない唾液中の UA レベルを測定し、その後血清 UA レベルを従来の UA アッセイ (Salimetrics®) に基づくものと比較しました。 Salimetrics® アッセイによって測定された唾液 UA レベルは、当社の UA センサーで測定されたものよりも大幅に高かったですが、血清 UA レベルと有意な相関がありました。 さらに、当社の UA センサーは、唾液 UA レベルの変化が、Salimetrics® アッセイよりも血清 UA レベルの変化をより厳密に反映していることを示しました。 したがって、調製された UA センサーである UOx-paper/PPD/PrB-SPCE は、UA 関連疾患を有する被験者の唾液 UA レベルを評価するための POCT に利用されることが期待されます。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、韓国政府（科学情報通信部、産業通商資源部、保健福祉部、食品医薬品安全部）からの韓国医療機器開発基金助成金によって支援されました。プロジェクト番号 KMDF_PR_20200901_0023、1711137928] および韓国政府が資金提供する国立研究財団助成金 (番号 NRF-2021R1A2C1093825)。

この作品は、ユン・ジョン・リー氏とギジャ・リー氏が共同で監修しました。

慶熙大学校医工学科、大学院、ソウル、02447、韓国

ソン・ヒョン・ハン＆ギジャ・リー

ソウル大学盆唐病院内科リウマチ科、京畿道城南市、13620、大韓民国

ユ・ジョンハ、ウナ・カン、ユン・ジョン・リー

ソウル市・ソウル大学ボラメ医療センターリウマチ科、ソウル、07061、大韓民国

シン・キチョル

13605、大韓民国京畿道城南市ソウル国立大学大学院医療機器開発学科

ユン・ジョン・リー

慶煕大学医学部生物医工学科、#1 Kyungheedae-ro, Dongdaemun-gu, Soul, 02447, Republic of Korea

イ・ギジャ

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Y.-JH、YJL、G.-JL は研究の構想と設計に貢献しました。 資料の準備、データ収集、分析はすべての著者によって実行されました。 原稿の最初の草稿は SHH と G.-JL によって書かれ、YJL、EHK、Y.-JH、KS が原稿の以前のバージョンにコメントしました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

Yun Jong Lee または Gi-Ja Lee への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

ハン、SH、ハ、YJ、カン、EH 他ウリカーゼ紙一体型電極を使用した、希釈されていない人間の唾液中の尿酸の電気化学的検出。 Sci Rep 12、12033 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-16176-5

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受信日: 2022 年 3 月 16 日

受理日: 2022 年 7 月 6 日

公開日: 2022 年 7 月 14 日

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