ナノチューブとセレンまたは銀の組み込みにより電気化学的に修飾されたチタン表面における抗菌力と骨芽細胞の増殖

Scientific Reports volume 12、記事番号: 8298 (2022) この記事を引用

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銀、亜鉛、銅を含むチタンナノチューブの表面は、骨芽細胞の増殖を低下させることなく抗菌効果を示しました。 この in vitro 研究では、電気化学的堆積によってセレンと銀の化合物を二酸化チタン (TiO2) ナノチューブに組み込むことによる表面修飾の生物学的評価に関する最初の結果を紹介します。 TiO2 ナノチューブ (TNT) およびリン酸ドープ TNT (pTNT) は、陽極酸化によって Ti6Al4V ディスクの表面上に成長しました。 ヒドロキシアパタイト (HA)、セレン (Se)、および銀 (Ag) 化合物が電気化学堆積によって組み込まれました。 表皮ブドウ球菌 (DSM 3269) のコロニー形成単位は、SepTNT (0.97 ± 0.18 × 106 CFU/mL)、SepTNT-HA (1.2 ± 0.39 × 106 CFU/mL)、AgpTNT (1.36 ± 0.42 × 106 CFU/mL) で有意に減少しました。 ) および Ag2SepTNT (0.999 ± 0.12 × 106 CFU/mL) を非改変対照 (2.2 ± 0.21 × 106 CFU/mL) と比較しました。 細菌の付着は、蛍光染色後の覆われた領域を測定することによって計算されました。 接着力は、SepTNT (37.93 ± 12%; P = 0.004)、pTNT (47.3 ± 6.3%、P = 0.04)、AgpTNT (24.9 ± 1.8%; P < 0.001)、および Ag2SepTNT (14.9 ± 4.9%; P < 0.001) で低かった。 ）非改変対照（73.7±11％）と比較した。 クリスタルバイオレット染色を使用して、バイオフィルムの形成と骨芽細胞（MG-63）の増殖を観察しました。 バイオフィルム形成は、非改変対照 (54 ± 8%) と比較して、SepTNT (22 ± 3%、P = 0.02) および Ag2SepTNT ディスク (23 ± 11%、P = 0.02) で減少しました。 非修飾対照と比較して、修飾 SepTNT-HA および pTNT 表面は、骨芽細胞 MG-63 細胞で著しく高い被覆面積を示しました。 走査型電子顕微鏡 (SEM) 画像により、細菌細胞と骨芽細胞の増殖に関する所見が確認されました。 これらの発見は、セレンおよび銀とチタンナノチューブを組み合わせることで潜在的な相乗効果が得られることを示しています。

人工関節周囲感染症（PJI）は依然として全関節形成術（TJA）後の最も困難な合併症の 1 つであり、患者の罹患率と死亡率に劇的な影響を与えるだけでなく、公衆衛生システムに対する社会経済的負担にもなっています1、2、3。 、4、5、6。

抗生物質耐性の増加が続いているため、新しい抗菌治療アプローチのために多くの努力がなされてきました7。 二酸化チタン (TiO2) ナノチューブ (TNT) の形成は、整形外科関連表面における抗菌性と骨結合性の可能性により、すでに注目を集めています 8、9、10。 TNT は細菌の付着を阻害することでチタン表面の細菌を減らすことが提案されています。 これは、TNT11 の管状構造による高い親水性と細菌細胞の凝集の低下により実現できます。 別のオプションは、インプラント表面に殺菌特性を持つコーティングを適用することです。 銀12、13、14、15、16、亜鉛17、セレン18、19、20、21、22などの細菌を殺すイオンの使用が研究されており、銀でコーティングされたインプラントはすでに市販されています。 さらに、TNT の抗菌メカニズムとは異なり、これらの金属はイオン放出によって細菌細胞を殺します10。 この効果は、これらの金属のナノ粒子を使用することで高めることができます10。 さらに、TNT の使用は骨形成能を高めることが示されています 23。これはセレンについても報告されている可能性があります 21,24。 しかし、銀化合物が細胞毒性効果により骨形成に悪影響を与える可能性があるという証拠がいくつかあります25。 したがって、たとえ一部の後ろ向き研究で高リスク患者の PJI の減少が示されたとしても、現時点では通常の関節形成術患者に対する世界的な銀イオンの使用を裏付ける十分な証拠はありません 26。 Holinka et al.27 による研究では、セレンを使用すると、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌 (表皮ブドウ球菌) の細菌細胞の増殖とバイオフィルム形成が減少することが明らかになりました。 しかし、ドーピング/浸漬機構を使用してナノ構造表面にセレンを組み込むと、セレンの堆積の制御が難しくなります。 ヒドロキシアパタイト (HA) は、セメントレス インプラントで最も一般的に使用される添加剤の 1 つです。 リン酸カルシウム水酸化物化合物からなる無機ミネラルは、骨誘導剤の代表的なものです。

陽極酸化処理を使用することで、私たちの研究グループは均一な形状の TNT を形成する戦略を開発することができました。 さらに、電気化学的堆積により、粒子（純金属またはその化合物）および他の有益な薬剤（例：HA）をナノチューブ内またはナノチューブ上に組み込むことが可能になり、最終的に抗菌性および骨結合性の可能性が高まりました28,29。 さらに、抗菌特性とオッセオインテグレーションを提供し、ナノチューブ内に抗菌剤を堆積するための十分なスペースを提供するために、望ましい幅 100 nm の TNT を作成することができました。 この方法により、異なる抗菌組成物の組み合わせが相乗的な抗菌効果と骨結合効果を高めることが可能になります。 本研究は、新しく形成された表面の抗菌効果を調査し、インビトロ研究で骨芽細胞の増殖を評価することを目的としました。 我々は、セレンと銀をドープした TiO2 ナノチューブの細菌付着、バイオフィルム形成、骨芽細胞の成長を、通常のチタン表面および HA ドープ TiO2 ナノチューブと比較しました。

TNT および pTNT に関して修飾を加え、Se、Ag、および HA を電気化学的に堆積させたチタン ディスクの表面を、表面特性に関してさらに調査しました。 EDX による元素組成分析により、SepTNT および SepTNT-HA ディスク表面上の Se の量は平均 29.9 ± 6.4 wt% であることが示されました。 Ag2SepTNT ディスク表面上の Se と Ag の平均量は、それぞれ 17.8 ± 5.4 wt% と 18.8 ± 9.4 wt% でした。 Ag-pTNT ディスク表面上の平均 Ag wt% は 6 ± 2 wt% でした。 ディスク表面の可視化は、空間解像度を高めるためのショットキー電界放出源を備えた走査電子顕微鏡 (SEM; ZEISS SIGMA HD VP) によって実行されました (図 1)。 現在の表面改質による表面特性および特性に関するさらなる情報は、すでに公開されています 28。

ディスク表面の走査型電子顕微鏡 (SEM) 画像：（A）未修正のコントロール。 (B) リン酸ドープチタンナノチューブ (pTNT)。 (C) セレンが組み込まれたリン酸ドープ TiO2 ナノチューブ (SepTNT)。 (D) ハイドロキシアパタイトでコーティングされた (HA) リン酸ドープ TiO2 ナノチューブ。 (E) ハイドロキシアパタイトコーティングを施したセレンを組み込んだリン酸ドープ TiO2 ナノチューブ (SepTNT-HA)。 (F) 銀セレンを組み込んだリン酸ドープ TiO2 ナノチューブ (Ag2SepTNT)。

サンプルを表皮ブドウ球菌とインキュベートし、超音波処理して細菌細胞を剥離した後、寒天プレート上の CFU/mL を評価しました。 SepTNT (0.97 ± 0.18 × 106 CFU/mL; P = 0.001)、SepTNT-HA (1.2 ± 0.39 × 106 CFU/mL; P = 0.001)、AgpTNT (1.36 ± 0.42 × 106 CFU/mL; P = 0.002) および Ag2SepTNT (0.999 ± 0.12 × 106 CFU/mL; P = 0.001) を非改変対照 (2.2 ± 0.21 × 106 CFU/mL) と比較しました。 図 2 には、この研究のすべての細菌実験 (CFU、バイオフィルム、および蛍光染色) が含まれています。 図 3 は、CFU カウント実験の結果を示しています。 細菌細胞接着は、SepTNT (38 ± 12%; P = 0.004)、pTNT (47 ± 6%、P = 0.040)、AgpTNT (25 ± 2%; P < 0.001)、および Ag2SepTNT (15 ± 5%; P < 0.001) で有意に低かった。 P < 0.001)、非改変対照 (74 ± 11%) と比較。 SEM 画像は細菌数実験の結果を反映しています。 SEM 画像の例を図 4 に示します。Ag コーティング (AgpTNT および Ag2SepTNT) を備えた SEM 画像は、CFU よりも表面上の細菌細胞の数が多い銀および銀セレン粒子の取り込みを示しています。カウント。 しかし、粒子を摂取した細胞はもはや生存できないように見えました (図 4)。

細菌細胞の接着とバイオフィルムの形成: 改変ディスク上で表皮ブドウ球菌を培養することにより細菌細胞数 (左上) を評価しました。 インキュベーション後、ディスクを超音波処理し、上清を寒天プレートに移し、一晩培養した。 ＣＦＵ／ｍＬは、画像処理ソフトウェアを用いて細胞を計数することによって評価した。 表皮ブドウ球菌とのインキュベーションおよびクリスタルバイオレット染色後のチタンディスク上のバイオフィルム形成（右上）。 バイオフィルムは、画像処理ソフトウェアを使用して覆われた領域を分析することによって測定されました。 細菌細胞の接着は、SYTO 9 で蛍光染色した後 (下の画像)、覆われた面積を計算することによって測定されました。 セレン銀で修飾されたディスクは、細菌細胞の接着とバイオフィルム形成の明らかな減少を示しました。 (A) 未修飾のコントロール。 (B) リン酸ドープチタンナノチューブ (pTNT)。 (C) セレンが組み込まれたリン酸ドープ TiO2 ナノチューブ (SepTNT)。 (D) ハイドロキシアパタイトでコーティングされた (HA) リン酸ドープ TiO2 ナノチューブ。 (E) ハイドロキシアパタイトコーティングを施したセレンを組み込んだリン酸ドープ TiO2 ナノチューブ (SepTNT-HA)。 (F) 銀/セレンを組み込んだリン酸ドープ TiO2 ナノチューブ (Ag2SepTNT)。

修飾および非修飾 (対照) チタン ディスクの表面上で 24 時間インキュベートした後の表皮ブドウ球菌のコロニー形成単位 (* P < 0.05)。 セレンが組み込まれたリン酸ドープ TiO2 ナノチューブ (SepTNT)、ヒドロキシアパタイト コーティングを施したセレンが組み込まれたリン酸ドープ TiO2 ナノチューブ (SepTNT-HA)、リン酸ドープ TiO2 ナノチューブ (pTNT)、チタン ナノチューブ (TNT)、銀が組み込まれたリン酸チタン−ドープＴｉＯ２ナノチューブ（ＡｇｐＴＮＴ）、銀セレンを組み込んだリン酸ドープＴｉＯ２ナノチューブ（Ａｇ２ＳｅｐＴＮＴ）、および未修飾対照（Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ）。

表皮ブドウ球菌との 24 時間のインキュベーション後のディスク表面の走査型電子顕微鏡 (SEM) 画像。 (A) 非改変コントロールにはいくつかの細菌コロニーが示されています。 (B) リン酸ドープ TiO2 ナノチューブ (pTNT) の使用により、細菌の増殖が増加する傾向があります。 (C) 追加のセレン取り込み (SepTNT) により、細菌コロニーが大幅に減少します。 (D) ハイドロキシアパタイト コーティング (HA) は細菌の増殖を抑制できませんでした。 (E) HA コーティングと組み合わせたセレンの存在下では、細菌の明確な減少が検出されました。 (F) 銀セレンを組み込んだリン酸ドープ TiO2 ナノチューブ (Ag2SepTNT) の表面で明確な細菌コロニーが検出されましたが、ほとんどの細菌は生存しておらず、すでに銀セレン粒子を摂取していました。 粒子を摂取していない単一の細菌細胞はほんのわずかしか見えませんでした。

クリスタル バイオレット染色により、非改変対照 (54 ± 8%) と比較して、SepTNT- (22 ± 3%、P = 0.020) および Ag2SepTNT ディスク (23 ± 11%、P = 0.020) でのバイオフィルム形成の大幅な減少が明らかになりました。 バイオフィルム染色の結果を図 5に示します。

修飾チタンディスクと非修飾チタンディスクのバイオフィルム被覆率。 セレンおよび銀セレンを組み込んだリン酸ドープ TiO2 ナノチューブ (SepTNT、Ag2SepTNT) はバイオフィルム形成の大幅な減少を示しましたが、リン酸ドープ TiO2 ナノチューブを備えたヒドロキシアパタイトでコーティングされたディスクは、非改変対照と比較してバイオフィルム形成の増加を示しました。

サンプルをMG63細胞とインキュベートした後、ディスクをクリスタルバイオレットで染色して、骨芽細胞の増殖を測定しました。 非改変対照と比較して、(57 ± 29%) SepTNT-HA ディスク (93 ± 2%; 0.027) および pTNT ディスク (90 ± 4%、P = 0.040) は、骨芽細胞性 MG- 63セル。 HA コーティングされたディスクと比較した場合、骨芽細胞の増殖に差異は検出されませんでした (90 ± 3%)。 図 6 は、ディスク上の MG-63 細胞の被覆率を示しています。 チタン表面上のMG-63のSEM画像を図7に示します。

修飾および非修飾チタンディスク上での骨芽細胞の増殖。 ハイドロキシアパタイトコーティングを施したセレンを組み込んだリン酸ドープ TiO2 ナノチューブ (SepTNT-HA) およびリン酸ドープ TiO2 ナノチューブ (pTNT) は、骨芽細胞の増殖の大幅な増加を示しました。

骨芽細胞株 MG-63 と 24 時間インキュベートした後のディスク表面の 2 つの異なる倍率 (100 倍および 1000 倍) での走査型電子顕微鏡 (SEM) 画像。 (A) 非改変コントロール。 (B) リン酸ドープ TiO2 ナノチューブ (pTNT) を含むサンプルには、対照と比較してより多くの生存可能な骨芽細胞が含まれているようです。 (C) セレンの取り込み (SepTNT) により、細胞密​​度と凝集が大幅に増加します。 (D) pTNT 上のヒドロキシアパタイト コーティング (HA) は、より多くの骨芽細胞を示しましたが、凝集はより少ないことを示しました。 (E) HA と組み合わせたセレン pTNT は特異な骨芽細胞形成を示しましたが、検出される凝集は少ないようでした。 (F) Ag2SepTNT は、SepTNT と比較して骨芽細胞の増殖が少ないことを示しました。

TJA および再置換術の数が増加しているため、TJA 後の敗血症性合併症の発生率が増加しているため、PJI を予防するための新しい治療戦略の必要性がますます重要になっています5。 抗菌力を高めるためのチタンインプラント表面の改質は、それらの新しい予防アプローチの 1 つです。 この研究では、銀セレン化合物とチタンナノチューブの形成を併用することにより、電気化学的に修飾されたチタン表面上での表皮ブドウ球菌の増殖の減少に関する有望な結果について報告します。

この研究はいくつかの限界を示しており、私たちの結果は次の要因と相対的に考慮する必要があります。

第一に、この研究は in vitro 研究であり、これらの発見を実際の臨床応用環境に翻訳するには限られた信頼性しか提供しません。 特に、修飾された表面の骨形成の可能性については、生体内モデルでの免疫組織学的および生体力学的評価の観点からさらなる分析が必要です。 また、改変されたインプラントに対する宿主の反応を調査するには、ヒトの臨床研究への移行を進めるために動物実験が必要です。 第二に、改変ディスクの製造コストが高いため、他の病原体や、この研究で説明したものとは異なる結果を示した可能性のある培養後のより多くの時点を調査することができませんでした。 第三に、インビトロ研究環境では、チタンディスクのセレンコーティングによる副作用の可能性を調査することができません。 しかし、重症患者における高用量の亜セレン酸ナトリウムの静脈内投与の使用に関する報告があり、有害な副作用は検出されませんでした30。 それにもかかわらず、ヒトインプラントへのセレン/ナノチューブ表面修飾の臨床使用についてさらなる予測を与える前に、動物研究設定に関するさらなる研究が必要であることは避けられないと思われる。

ナノチューブの形状のチタン表面のナノ構造化は、骨形成細胞の細胞接着、成長および分化を改善するために過去にすでに注目を集めてきました 31,32,33。 また、TiO2 ナノチューブは、従来のセメントを使用しない人工膝関節全置換術システムの表面にすでに使用されており、オッセオインテグレーション挙動と抗菌効果の改善を示しています 33。 ペンら。 彼らの研究では、チタン表面でのナノチューブの形成が表皮ブドウ球菌の増殖の減少につながると説明しています34。 私たちの研究では、TiO2 ナノチューブ (pTNT および TNT) は、24 時間のインキュベーション後に非修飾チタン表面と比較して表皮ブドウ球菌の接着が減少する傾向を示しました。 しかし、細菌細胞の減少に明確な効果が見られなかった理由は、私たちの研究におけるナノチューブのサイズの違い（100 nm）によるものである可能性があります。 しかし、私たちの研究グループによるこれまでの研究では、チューブ直径 70 nm でのバイオフィルム形成の増加を見ることができました。 SEM 調査では、直径 100 nm のチューブでバイオフィルムの減少が示されました 28。

TiO2 ナノチューブ表面の抗菌能力を高めるために、ナノチューブのコーティング/充填物を追加したいくつかの研究が発表されています 35。 2007 年という早い時期に、Popat らは彼らは、ゲンタマイシンを充填した TiO2 ナノチューブを使用すると、表皮ブドウ球菌の増殖が減少することを示すことができました。 それにもかかわらず、抗生物質耐性の問題が増大しているため、PJI に対する代替抗菌戦略にとってそれが極めて重要であると私たちは考えています。 したがって、銀や銅などのさまざまな抗菌基材の使用がコーティング材料として導入されています。 銀は縁起の良い抗菌効果を示しており、PJI のような巨大プロテーゼや再置換術システムを開発するリスクが高い患者の関節形成インプラントに広く使用されています 26。 しかし、毒性 16 のため、一次全関節置換術における予防薬として銀を広く使用することは不可能であり、そのため、再置換術および腫瘍切除後の再建にのみ限定されます。 さらに、毒性効果のため、銀コーティングは骨に直接接触していないインプラント部分にのみ適用できます26。私たちの研究では、銀とセレンをドープしたナノチューブの組み合わせで細菌増殖の最も高い減少が観察されました。 これは、TNT の根底にある抗菌メカニズムと、相乗的な抗菌効果の環境を作り出す銀セレンの堆積によるものではないかと我々は推測しています。まず、TNT は、その材料特性 (親水性、管状構造、粗さ) により細菌の付着を減少させることができます。骨芽細胞の増殖を増加させながら細菌の凝集を抑制する10. 私たちの研究グループは、2 つの異なるメカニズムを示すことができました。1 つは、表面特性による酸素存在下でのセレン化銀表面上の H2O2 に関する活性酸素種 (ROS) の自発的触媒形成と、(有毒な) 銀の放出です。還元条件下での銅およびセレンイオン29. したがって、私たちの発見は、チタン表面での細菌細胞の増殖を減少させる有益な相乗メカニズムを強調するために重要であると信じています。 さらに、これらの発見は、セレンの組み合わせにより抗菌性を損なうことなく、銀濃度を下げて毒性レベルを下げるのにも役立つ可能性があります。

整形外科用抗菌インプラントコーティングへのセレンの使用は、Holinka et al.27 によってすでに記載されています。 研究の中で、著者らは亜セレン酸ナトリウム濃度が異なると黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌の細菌増殖が減少することを発見した。 さらに、著者らは、骨芽細胞 MG-63 細胞の増殖は減少していないと述べています。 TiO2 ナノチューブとセレンの組み合わせの使用は、Bilek et al.24 による最近の研究で説明されており、彼らの発見は我々の研究の発見と一致しています。 しかし、単純な浸漬 27 や洗浄方法 24 による表面のコーティングでは、必ずしも表面全体にセレン粒子が一定かつ均等に分布することが保証されるわけではないと考えています。 したがって、私たちが提案した方法は、標準化された方法でチタニアナノチューブに所望の量のセレンを充填するのに信頼性が高いことが示されています28。 さらに、私たちのグループの最近の研究では、セレン化物（Ag2Se、Cu2Se）の抗菌効果が、イオン放出とH2O2酸化種を形成する間接酸素還元反応（ORR）の両方に関連している可能性があることが明らかになりました29。 興味深いことに、定性マーカーとしての SEM 画像は、CFU カウントとかなりの相関関係を示しました。 しかし、Ag2SepTNT 表面では、検出された CFU 数よりも SEM 画像でより多くの細菌が示されました (図 4)。 SEM画像を詳しく見ると、多くの細菌コロニーがすでに細胞内Ag2Seコロイドを示していることがわかりました（図8）。 したがって、銀の殺菌効果と同様に、Ag2Se が細胞膜を劣化させ、細菌の DNA と相互作用して細菌の死を引き起こすのではないかと考えられます。

細菌細胞内の Ag2Se 化合物を示す Ag2SepTNT ディスクの SEM 画像および EDX プロファイル。

興味深いことに、HA コーティングされたナノチューブでは、未修飾のコントロールと比較して、ほぼ同様の CFU 数とさらに高いバイオフィルム形成が見られました。 これは、HA 粒子のサイズがナノチューブの開口部をほぼ覆っているため、ナノチューブの抗菌効果が妨げられる可能性があるためであると我々は考えています。 HA の機械的特性により、バイオフィルムは簡単には剥がれない可能性があります。 この現象は他の研究でも観察され、確認されました 36,37。 さらに、HA は TNT の開口部を覆い、TNT の抗菌能力を低下させる可能性があります。 興味深いことに、セレンを堆積すると (SepTNT-HA)、抗菌力が増加しました。 したがって、私たちは、提案した方法で HA と TiO2 ナノチューブを組み合わせて使用​​することを推奨しません。 マケボイら。 らは、コーティングされていない Ti6Al4V ワイヤと比較して、HA コーティングされたキルシュナー線での細菌の増殖の増加に関して同様の結果を発見しました 38。

私たちの発見によると、セレンをドープした TiO2 ナノチューブの使用は、通常のチタン表面と比較して、骨芽細胞の成長に影響を与えません。 ナノチューブの使用により骨芽細胞の増殖が促進されるという報告があります 39,40。 ただし、約 70 nm の直径を使用すると、骨形成および骨関連遺伝子の発現レベルが増加しました。 私たちの研究では、バイオフィルムの形成を減らすために意図的に 100 nm を使用しました。 それにもかかわらず、ここで提示した表面改質方法では抗菌力を高めながら骨芽細胞の増殖が損なわれないため、これらの発見は有望であると依然として考えています。 いくつかの研究では、チタン表面にセレンを組み込むことで骨芽細胞の接着が増加することさえ報告しており 41、前述したように、チタンナノチューブの使用はオッセオインテグレーションの可能性を高めることが示されています 31,32,33。 ただし、異なる研究では異なる骨芽細胞株が使用されているため、これらの発見は互いに正確に比較できない可能性があります。 また、我々のデータによれば、TiO2 ナノチューブの形成は細菌の付着を十分に減少させません。 セレンおよび/または銀などの抗菌剤を添加すると、TiO2 ナノチューブで修飾された表面の抗菌能力が大幅に高まります。

TiO2 ナノチューブと組み合わせたセレン化銀が最良の細菌還元効果を示す理由は複雑で、化合物中にある場合に活性酸素種の形成を促進する銀とセレンの相乗効果に関連している可能性があります。 抗菌性金属イオンのゆっくりとした放出と、ナノチューブ構造によってあらかじめ決められた表面トポグラフィーが、観察された効果に寄与しています。 溶解によって引き起こされる H2O2 の形成と金属イオンの放出により、細菌膜の透過性が増加し、最終的に細菌の DNA が劣化します。 化合物中でセレンと銀を組み合わせると、純粋な金属を別々に使用する場合と比較して、放出されるイオンの潜在的な毒性レベルを低減できるという利点もある可能性があります。

結論として、この研究では、TiO2 ナノチューブによる新規な表面修飾とその後の追加の抗菌剤の組み込みの抗菌性と骨結合性の可能性を示します。 これにより、非修飾対照と比較して、SepTNT、SepTNT-HA、AgpTNT、および Ag2SepTNT 上の細菌増殖が大幅に減少し、SepTNT-HA および pTNT 表面の骨芽細胞 MG-63 細胞による被覆面積が大幅に増加しました。 セレンと銀とチタンナノチューブの相乗効果が検出され、これらの表面修飾の抗菌力を高める可能性があるため、これらの発見は非常に重要である。 さらに、チタンナノチューブ表面に組み込まれたヒドロキシアパタイトは、骨結合能の向上を示しますが、ナノチューブ表面にヒドロキシアパタイトを添加すると抗菌効果は減少します。 これらの発見は、将来の PJI を予防するための新しい治療戦略を見つけるための動的な in vitro および in vivo 実験の観点からのさらなる研究の基礎となります。

電気化学的表面改質は研究グループによる以前の研究に基づいており、すでに詳細に説明されています28。 簡単に説明すると、直径 10 mm、厚さ 1 ～ 2 mm のチタン ディスク (Ti6Al4V) を研削、研磨、脱脂し、エタノールと脱イオン水で洗浄しました。 ディスクの表面上のナノチューブの形成は、ディスクを陽極とし、Ｐｔ箔を対極として機能させる２電極構成で、３０Ｖの定電位で陽極酸化することによって生成された。 10 vol% の再蒸留水、0.12 M NH4F、および 10 mM (NH4)NaH(PO4) 4H2O を含むエチレングリコールベースの電解質が使用されています。 これまでの研究では、エチレングリコールベースの電解質には均一なナノチューブを形成する可能性があることが示されています28。 陽極酸化後、ディスクをエチレングリコール中で超音波処理して洗浄し、その後空気中でアニールして (450 °C、2 時間)、TiO2 相をアナターゼに変換し、ナノチューブ (TNT) およびリン酸ドープ ナノチューブ (pTNT) の形成を完了しました。ディスクのチタン表面に。

準備したままの pTNT 内でのセレン (Se)、銀 (Ag)、セレン化銀 (Ag2Se) の電気化学堆積を 3 電極構成で実行しました。 pTNT は対極として機能し、Ag/AgCl は参照電極として機能します。 セレンは、Na2SeO3 電解質中で陰極パルスによって堆積されました。 セレン化銀は、０．５Ｍ ＮａＳＣＮ、５ｍＭ ＡｇＮＯ ３ および２．５ｍＭ Ｎａ ２ ＳｅＯ ３ を含む溶液から堆積された。 さらに、2.5 mM Na2SeO328 の存在下および非存在下で、2.5 mM Ca(NO3)2 4H2O および 1.5 mM (NH4)NaH(PO4) 4H2O から電気化学的に補助された沈殿によって、Se-pTNT および pTNT ディスクのセットをヒドロキシアパタイト (HA) で付加的にコーティングしました。 電気化学的表面修飾後、準備したままの表面をさらなる in vitro テストに使用しました。

Ti6Al4V (コントロール)、pTNT、TNT、pTNT-HA、SepTNT、SepTNT-HA、AgpTNT、Ag2SepTNT。 表面領域の Se と Ag の濃度は、結合エネルギー分散型 X 線 (EDX) 検出器 TEAM OCTane PLUS バージョン 4.3 を使用して、ディスク表面のランダムに選択した領域をスキャンすることによって決定されました。 成分組成の平均パーセント (重量%、重量%) として表されます。 EDXマッピングによる元素組成、RAMAN分光法による化学組成、誘導結合プラズマ質量分析法（ICP-MS）を使用したイオン放出プロファイルなどの表面特性と特徴のさらなる特性評価が実施されており、以前に発表されています28、29。

この研究では、表皮ブドウ球菌 (表皮ブドウ球菌) のバイオフィルム形成株 (DSM 3269; ドイツ微生物および細胞培養コレクション GmBH、ライプニッツ、ドイツ) を使用しました。 細菌を、5% 羊血液を含むコロンビア寒天プレート (Biomerieux、Craponne、France) 上で 37 °C で一晩増殖させ、4 °C で保存しました。 各実験では、新しい血液寒天プレートに菌株を接種し、一晩インキュベートしました。 このプレートから、マクファーランド 0.5 の光学密度を有する 0.9% 食塩水中の細菌懸濁液を使用し、その後 Mueller-Hinton ブロス (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州) で 1:100 に希釈しました (約 1 × 106 細胞/ ml) 細菌細胞数およびバイオフィルム形成実験用。

各コーティングのディスクを 3 つずつ 2 回実験に使用しました。 ディスクを２４ウェルプレートに置き、記載した細菌細胞懸濁液１ｍｌを各ウェルに移した。 ウェルプレートを密閉し、周囲空気中、37℃で24時間インキュベートした。 インキュベーション後、ディスクをＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）で２回洗浄した。 その後、ディスクをＰＢＳ（Ｂａｎｄｅｌｉｎ Ｓｏｎｏｒｅｘ Ｓｕｐｅｒ ＲＫ １００）中で４４ｋＨｚの強度で１０分間超音波処理した。 得られた超音波処理液 (10 ml) を 1 ml アリコートでコロンビア寒天プレートにプレーティングし、再び周囲空気中 37 °C で 24 時間インキュベートしました。 インキュベーション後、プレートの写真を撮り、ImageJ ソフトウェア (バージョン 2.1.0) で 1 ミリリットルあたりのコロニー形成単位 (CFU) (CFU/mL) をカウントしました。 追加の 3 つのディスクを 24 ウェル プレート内で細菌懸濁液と 37 °C、周囲空気中で 24 時間インキュベートしました。 インキュベーション後、ディスクを PBS で注意深く洗浄し、メタノールで固定しました。 その後、細菌の付着を視覚化するためにディスクの表面を SEM で再度分析しました (図 1)。

ディスクを上記のように細菌懸濁液とともにインキュベートした。 37℃で24時間インキュベートした後、ディスクを蒸留水で2回注意深く洗浄しました。 3μlのSYTO 9の溶液を1mlの濾過滅菌水に添加した。 ディスクをＰＢＳ中で穏やかに洗浄し（３ｍｌ、３回）、７５０μｌの染色溶液をディスク上に添加した。 染色皿を覆い、サンプルを光から保護して室温で 20 ～ 30 分間インキュベートしました。 インキュベーション後、サンプルをフィルター滅菌水で再度リンスし、蛍光顕微鏡 (Zeiss Axioplan 2 蛍光位相差顕微鏡、Carl Zeiss、イエナ、ドイツ) で倍率 10 倍で観察しました。

追加のディスク（３連）を細菌懸濁液で再度インキュベートし、その後メタノールで固定し、１％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）で１５分間染色し、蒸留水で再度洗浄し、風乾した。 その後、標準化された条件 (背景、照明、レンズまでの距離) の下でディスクの写真が撮影され、ImageJ ソフトウェア (バージョン 2.1.0) を使用してカバーされた領域の計算が実行されました。 染色は、各コーティングについて 3 つずつ 2 回実行しました。

骨芽細胞の増殖に対する影響を検出するために、American Type Culture Collection (ATCC、米国、バージニア州、CRL-1427) から購入した骨芽細胞株の MG-63 細胞を 25 cm2 組織培養フラスコ (Falcon、Thermo Fisher Scientific、Slangerup) で培養しました。 、デンマーク）を、5％CO2を含む加湿雰囲気中で10％FCSを含むAlpha-MEM（PAN-Biotech、アイデンバッハ、ドイツ）中で培養し、37℃でインキュベートした。 約 70% コンフルエンスで、細胞をトリプシン/EDTA (Gibco ™、Thermo Fisher Scientific、Slangerup、デンマーク) で剥離し、Alpha-MEM + FCS で希釈して、最終濃度 1.5 × 105 細胞/ml を得ました。 1 ml の溶液を各チタンディスクに接種し、37 °C、5% CO2 の加湿雰囲気中で 24 時間インキュベートしました。 インキュベーション後、ディスクを蒸留水で洗浄し、メタノールで10分間固定した。 ディスクを蒸留水で洗浄し、クリスタルバイオレットで15分間染色し、蒸留水で再度洗浄し、風乾した。 その後、標準化された条件 (背景、照明、レンズまでの距離) の下でディスクの写真が撮影され、ImageJ ソフトウェア (バージョン 2.1.0) を使用してカバーされた領域の計算が実行されました。 染色は、各コーティングについて 3 つずつ 2 回実行しました。

結果は平均値と標準偏差 (SD) として表示されます。 数値変数 (CFU/mL、カバー面積 (%)) を一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して分析し、Tukey-HSD 事後検定を使用して比較しました。 結果は、P 値 < 0.05 で統計的に有意であるとみなされました。 統計分析は、SPSS 26.0.0.1 (SPSS Inc. IBM、シカゴ、米国) を使用して実行されました。

すべての著者は、この研究に関して競合する利害関係がないことを宣言します。 RW は、提出された作品とは別に、DePuy Synthes (米国インディアナ州ワルシャワ) および Stryker (米国ミシガン州カラマズー) からロイヤルティを受け取ります。

各著者は、自分の所属機関がこの調査の研究計画書を承認し、すべての調査が研究の倫理原則に従って行われたことを証明します。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。

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ケヴィン・スターツ、マグダレーナ・ピルツ、ラインハルト・ヴィントハーガー、ヨハネス・ホリンカ

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ジエ・スン & ツベタンカ・ボイアジエヴァ・シャーツァー

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ヘルマン・クロンバーガー

ウィーン医科大学、感染症・熱帯医学部門、第一内科、ウィーン、オーストリア

セルマ・トブディック

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転載と許可

Staats, K.、Pilz, M.、Sun, J. 他ナノチューブとセレンまたは銀の組み込みにより電気化学的に修飾されたチタン表面での抗菌力と骨芽細胞の増殖。 Sci Rep 12、8298 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-11804-6

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受信日: 2022 年 1 月 24 日

受理日: 2022 年 4 月 5 日

公開日: 2022 年 5 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11804-6

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