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Scientific Reports volume 12、記事番号: 14011 (2022) この記事を引用

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視床下核（STN）の脳深部刺激療法（DBS）は、パーキンソン病（PD）の標準治療法となっています。 しかし、かなりの数の患者に衰弱性の精神医学的副作用が発生します。 最近の研究では、外部刺激によってニューロン内の神経伝達物質の恒常性が変化する可能性があることが明らかになり、これは「神経伝達物質の再特定」として知られています。 本明細書では、神経伝達物質の再特定が、DBSが背側縫線核（DRN）のセロトニン作動性機能を抑制し、気分変化を引き起こすメカニズムである可能性があるかどうかを検討した。 トランスジェニック 5-HT-Cre (ePET-Cre) マウスに AAV ウイルスを注入し、メチル-4 フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン (MPTP) の前に、DRN 内で eYFP および遺伝的にコードされたカルシウム指標 GCaMP6 の標的発現を達成しました。 ） 処理。 カルシウム測光のために、マウスにはSTNに両側DBS電極を、DRNに光ファイバーを取り付けました。 MPTP 処置マウスは行動的および組織学的 PD 表現型を示しましたが、すべての STN-DBS 動物は強制水泳試験で不動時間の増加、カルシウム活性の低下、および DRN におけるトリプトファンヒドロキシラーゼ 2 発現の喪失を示しました。 神経伝達物質の再特定の媒介におけるカルシウム一過性の顕著な役割を考慮すると、これらの結果は、STN-DBS 後の DRN におけるセロトニン作動性表現型の喪失を示唆しています。 これらの発見は、セロトニン作動性細胞の表現型の喪失が、STN-DBS 後の望ましくない抑うつ症状の根底にある可能性があることを示しています。

脳深部刺激療法 (DBS) は、特定の神経疾患および精神疾患を治療するための脳外科治療として成功を収めています 1、2、3、4。 視床下核 (STN) の DBS は、特に医学的に難治性のパーキンソン病 (PD) の運動症状を効果的に改善することが示されています 5、6、7、8。 運動機能の長期的な改善にもかかわらず、一部の PD 患者は、手術後にうつ病、自殺念慮、衝動性などの気分障害を示します 9,10。

我々の以前の研究では、急性両側性STN-DBSが、中枢神経系における5-HTの主な供給源である背側縫線核（DRN）の中脳セロトニン（5-ヒドロキシトリプタミン; 5-HT）系の神経伝達を阻害することが示されている。そしてその機能不全は気分障害の発症と関連している11。 実験動物研究における急性 STN-DBS は、PD ラットにおける DRN 5-HT ニューロンの発火率の低下、前脳における 5-HT 放出の減少、およびうつ病様行動の誘発を実証しました 12,13。 ただし、臨床現場では STN-DBS が慢性的に適用されます。 神経ネットワークの長期的な変調は、永続的な神経可塑性変化を引き起こす可能性があります14。 より最近では、成熟した脳における神経伝達物質のアイデンティティが環境刺激によって影響を受ける可能性があることが証明されました 15。 行動出力の変化に関連する神経伝達物質の切り替え、誘導、または除去は、神経伝達物質の再指定と呼ばれます16、17、18。 我々は、神経伝達物質の再特定が STN-DBS で役割を果たし、DRN 5-HT システムで発生するという仮説を立てました。 これを調査するために、我々は、DRN 5-HT ニューロンの選択的標的化を可能にする転写因子 Pet1 のエンハンサー (ePET-Cre) の下で Cre を発現するトランスジェニック マウス系統を使用しました 19。 メチル-4フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン（MPTP）投与後にPD関連症状を呈したこれらのトランスジェニックマウスを、既存の研究と比較して比較的長期間毎日STN-DBSで治療した。 行動、測光、および免疫組織化学的評価を使用して、DRN 5-HT システムにおける神経伝達物質の再特定の側面を評価しました。

刺激電極は、電極が不定帯に配置された2匹を除くすべてのマウスのSTN内で左右対称に配置されました(電極間変動<0.1 mm)。 それらのマウスは分析から除外されました。 冠状脳断面における電極軌道の例と、STN マップにおけるすべての電極先端の位置は、補足資料 (図 S1A-B) に示されています。 ファイバー測光プローブは、信号処理から除外された 3 匹を除くすべてのマウスの DRN の背内側部分に配置されました。 移植または電気刺激による重大な組織学的損傷の兆候は観察されませんでした。

MPTP 処置マウスは、NaCl 処置グループと比較して PD 様の運動表現型を示しました。 MPTP 治療は、平均速度の低下を伴う重大な静的および動的歩行障害を誘発しました [MPTP-sham: 18.09 ± 0.62; MPTP 刺激: 23.91 ± 0.68; NaCl-sham: 22.90 ± 0.80、および NaCl-stim: 22.60 ± 1.17。 二元配置分散分析。 グループ効果: F(3,52) = 9.04、p < 0.001; 疾患*グループ効果: F(1,52) = 3.64、p < 0.001; 続いてボンフェローニのペア比較。 MPTP 偽 vs NaCl 偽: p < 0.001; 図1A]、ターミナルデュアルスタンスの増加[MPTP-sham: 0.021 ± 0.002; MPTP 刺激: 0.009 ± 0.001 NaCl 偽: 0.011 ± 0.001、および NaCl 刺激: 0.015 ± 0.002。 二元配置分散分析。 グループ効果: F(3,52) = 10.36、p < 0.001; 疾患*グループ効果: F(1,52) = 2.90、p = 0.160; 続いてボンフェローニのペア比較。 MPTP 偽 vs NaCl 偽: p < 0.001; 図 1B]、ステップサイクル [MPTP-sham: 0.31 ± 0.008、MPTP-stim: 0.24 ± 0.007; NaCl-sham: 0.25 ± 0.006、および NaCl-stim: 0.26 ± 0.008。 二元配置分散分析。 グループ効果: F(3,52) = 15.28、p < 0.001; 疾患*グループ効果: F(1,52) = 8.30、p < 0.01; 続いてボンフェローニのペア比較。 MPTP 偽 vs NaCl 偽: p < 0.001; 図 1C]、およびスタンス [MPTP-sham: 0.17 ± 0.005、MPTP-stim: 0.12 ± 0.004; NaCl-sham: 0.13 ± 0.004、および NaCl-stim: 0.14 ± 0.004。 二元配置分散分析。 グループ効果: F(3,52) = 23.08、p < 0.001、疾患*グループ効果: F(1,52) = 8.17、p < 0.001。 続いてボンフェローニのペア比較。 MPTP 偽対 NaCl 偽: p < 0.01; 図１Ｄ］。

MPTP 治療と断続的な STN-DBS が Catwalk の動的および静的歩行パラメータに及ぼす影響。 (A – D) グラフは、MPTP 偽マウスにおける速度の大幅な低下と、ステップ サイクル、ターミナル デュアル スタンスおよびスタンスの増加を示しています。 STN-DBS はこれらのパラメーターを対照レベルに回復しました。これは、MPTP 刺激グループと NaCl 偽グループ間の有意差がないこと、および MPTP 刺激グループと MPTP 偽グループ間の有意な差異によって示されます。 (E) グラフは、NaCl 処理動物と比較して、MPTP 処理マウスの SNc における TH 陽性細胞の有意な減少を示しています。 (F – G) TH で染色された SNc および VTA を含む冠状脳切片の代表的な低倍率顕微鏡写真は、MPTP 対 NaCl 処理マウスにおいて顕著な TH 細胞の減少を示しています。 データは平均 + /- SEM として表示されます。 有意差 (P < 0.05) は「*」で示されます。スケール バー = 250 μm。 チロシンヒドロキシラーゼ、TH; 黒質緻密部、SNc; 腹側被蓋野、VTA。 視床下核、STN。 メチル-4フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン、MPTP; 脳深部刺激、DBS。

さらに、STN-DBS は、MPTP 処理マウスのこれらの歩行パラメータを回復し、平均速度が大幅に増加し、終末二元スタンス、ステップサイクル、およびスタンスが減少しました [二元配置分散分析。 グループ効果: F(3,52) = 9.04、p < 0.001; F(3,52) = 10.36、p < 0.001; F(3,52) = 15.28、p < 0.001; それぞれ、F(3,52) = 23.08、p < 0.001。 刺激*グループ効果: F(1,52) = 9.07、p = 0.064; F(1,52) = 4.75、p < 0.05; それぞれ、F(1,52) = 12.02、p < 0.01、および F(1,52) = 17.95、p < 0.01]。 Bonferroni の平均値の事後ペア比較では、すべてのテストにおいて MPTP-sham と MPTP-stim の間に有意な差が示されました (p < 0.001、図 1A ～ D)。 さらに、刺激は、どの試験においても、ＮａＣｌ処置マウスの歩行パラメータ（ＮａＣｌ－偽対ＮａＣｌ－刺激）を変化させなかった（ボンフェローニ事後対比較：ｐ＞０．０５）。 死後の TH 免疫組織化学により、NaCl 治療と比較して MPTP 投与後の SNc ドーパミン作動性ニューロンの有意な減少 (平均 60%) が明らかになりました (MPTP 偽: 198.8 ± 30.54 対 NaCl 偽: 491.8 ± 43.82; 独立したサンプルの T 検定) p < 0.005;図 1E–G)。

DRN ニューロンのカルシウム過渡現象を評価するファイバー測光法では、GCaMP6s 蛍光の大幅な減少が示され、STN-DBS に対するニューロンの阻害が示されました (図 2A-D)。 順列試験では、MPTP 処理マウスと NaCl 処理マウスの両方で STN-DBS によるカルシウムシグナル伝達の減少が示されました (p < 0.05)。 刺激を停止すると、GcaMP6s の蛍光シグナルは 90 秒以内にベースラインに戻りました。

セロトニン作動系に対する STN-DBS の効果。 DRN の 5-HT ニューロンの活動に対する STN-DBS の効果は、遺伝的にコード化されたカルシウム センサー GCaMP6 (ファイバー測光) で測定されました。 (A) と (C) は、それぞれ MPTP および NaCl 処理マウスにおける DBS の前、最中 (刺激期間は縦線で示されている)、および後の蛍光変化 (dF/F) のヒートマップの例です。 各行は 1 つの DBS セッション (合計 10 回の試行) をプロットします。 右側のカラー スケールは dF/F を示します (黄色 = 高い、濃い青 = 低い dF/F)。 (B) および (D) 下のプロットは、MPTP 処理マウス (n = 14) および NaCl 処理マウス (n = 17) における 10 回の試験の平均をとった蛍光の累積変化を示しています。 太い黒い線は平均を示し、影付きの領域は SEM を示し、赤いセグメントはベースラインからの統計的に有意な減少を示します (DBS 期間は垂直の破線で示されます; p < 0.05; 順列検定)。 (E) STN-DBS は強制水泳試験において抑うつ様行動を誘発し、刺激を受けた動物の不動時間の増加によって示されました。 (F) グラフは、慢性 STN-DBS が MPTP 処理マウスと NaCl 処理マウスの両方のトランスフェクト (eYFP 発現) 細胞における TPH2 発現を有意に減少させたことを示しています。 (G)、(H) DRN を含む冠状脳切片の代表的な顕微鏡写真は、TPH2 に対して生じた抗体で二重標識された eYFP 発現細胞 (緑色) を表示します (赤色、スケール バー = 150 μm)。 (G、H) の挿入図は、TPH2 標識ありおよびなしの eYFP 細胞の高倍率を示しています (スケール バー = 50 μm)。 データは平均 + /- SEM として表示されます。 有意差 (P < 0.05) は「*」で示されます。 視床下核、STN、背側縫線核、DRN、増強黄色蛍光タンパク質、eYFP。 トリプトファンヒドロキシラーゼ-2、TPH2; メチル-4フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン、MPTP; 脳深部刺激、DBS。

溺死の危険があるため、FST検査は中止されました。 結果として、サンプルサイズが小さいため、4 つのグループを ANOVA 検定で比較することはできませんでした。 代わりに、刺激された動物 (NaCl 刺激および MPTP 刺激) のデータをプールし、偽動物 (NaCl 偽および MPTP 偽) 動物と比較しました (刺激: 139.56 ± 14.39 対偽: 88.93 ± 15.13; 独立したサンプルの T 検定) 、ｐ＜０．０５；図２Ｅ）。 STN-DBS は FST において行動的絶望を誘発しましたが、これは刺激を受けていないマウスと比較して不動時間が増加したことから明らかでした。 STN-DBS後のこのうつ病様行動は、MPTP処理マウスとNaCl処理マウスの両方で観察されました。

STN-DBS がうつ病様行動を誘発し、DRN におけるカルシウムシグナル伝達を減少させることを確立した後、続いて遺伝的に標的化された DRN 5-HT ニューロンの表現型を評価しました。 DRN 内の二重標識増強黄色蛍光タンパク質 (eYFP)/トリプトファンヒドロキシラーゼ 2 (TPH2) 発現ニューロンの立体学的細胞数は、偽刺激動物と比較して、STN-DBS 処置マウスにおける eYFP 陽性/TPH2 陰性ニューロンの有意な増加を示しました。 [MPTP および NaCl 刺激: 1670 ± 144 および 1590 ± 141、対 MPTP および NaCl 擬似: それぞれ 712 ± 50 および 518 ± 83。 二元配置分散分析。 グループ効果: F(3,14) = 27.60、p < 0.001; 疾患*グループ効果: F(1,14) = 1.48、p = 0.24; 刺激*グループ効果: F(1,14) = 81.08、p < 0.001; 図 2F–H]。 TPH2 発現に対する慢性 STN-DBS のこの阻害効果は、黒質線条体ドーパミン経路の完全性とは無関係であることが判明しました。これは、ボンフェローニによる平均値のポストホック対比較によってテストした場合、この観察が MPTP 処置マウスと NaCl 処置マウスの両方に存在したためです。 MPTP-sham 対 MPTP-stim: p < 0.001; NaCl-sham 対 NaCl-stim: p < 0.001; MPTP 模擬対 NaCl 模擬: p = 1.00、MPTP 刺激対 NaCl 刺激: p = 1.00。 図２Ｆ］。 さらに、STN-DBS 投与も MPTP 投与も DRN における神経細胞の c-Fos 発現を変化させず、グループ間の有意な変化は見つかりませんでした [二元配置 ANOVA; グループ効果: F(3,18) = 0.31、p = 0.81; 図S3]。 最後に、DRN 内の TPH2 および eYFP 発現細胞の定量化では、グループ間に有意な差は示されませんでした [二元配置 ANOVA; グループ効果: (それぞれ F(3,14) = 0.40、p = 0.76、および F(3,14) = 1.73、p = 0.21、図 S4)。

この研究では、神経伝達物質の表現型に対する DBS の神経可塑性の影響を調査しました。 最近、成人の脳における神経伝達物質の再特定が、外部からの手がかりによって神経伝達物質の表現型の切り替え、神経伝達物質の誘導または除去と、同時に行動の変化が引き起こされることが報告されました16、17、18。 私たちは、この現象が DBS に関与しているのではないかと仮説を立てました。 これは、刺激依存性の運動および非運動行動の変化を伴う医学的に難治性の PD において広く受け入れられている脳神経外科治療として、STN-DBS に特に関連している可能性があります 5、6、7、8。 患者は手術後に抑うつ症状を経験する可能性があり、それ自体が術後自殺の危険因子となります9,10。 これらの行動変化の神経機構を理解することは、すでに世界中で DBS の治療を受けている 208,000 人を超える患者にとって重要です。

我々は、TPH19を合成するDRNにおける5-HTニューロンの特異的評価を可能にするePET-Creマウス系統を使用した。 これらのマウスに MPTP を投与すると、SNc ドーパミンニューロンが大幅に減少し（約 60%、図 1E）、歩行障害が示されましたが、STN-DBS によって軽減されました。これは、全体としてドーパミン作動性変性を模倣し、PD 患者における刺激による有益な運動効果を示しました（図 1E）。 .1A～D）。

さらに、STN-DBS は MPTP マウスにおいて行動上の絶望を誘発し、これはうつ病様行動を反映していると考えられています (図 2E)。 STN-DBSによるこの行動変化は、NaCl処理マウスが同様の行動出力を示したため、黒質線条体経路および運動機能の完全性とは無関係でした（図S2）。 この観察は、我々の以前の研究でも報告されています12,21。 STN-DBS の前に選択的セロトニン再取り込み阻害剤シタロプラムによる前治療は、行動的絶望の予防に効果的でした 12。 これは、5-HT 依存メカニズムを正確に特定し、DRN が前脳への 5-HT 神経支配の主な供給源である、脳幹 5-HT システムに対する STN-DBS の下流効果を調査する実験を引き起こしました 11。

この研究では、カルシウムシグナル伝達のファイバー測光測定を使用して、断続的なSTN-DBSがカルシウムシグナル伝達を減少させ、DRN内でニューロンの抑制を引き起こすことを実証しました（図2A〜D）。 これは、細胞外単一細胞記録において刺激により 5-HT ニューロン発火率が 40 ～ 50 減少した急性 STN-DBS 電気生理学的実験と一致しています 12,22。 その後の in vivo 微量透析実験でも、予想どおり、終末前脳領域での 5-HT 放出の減少が見られました 13,23。 これまでの研究は、根底にある神経回路に焦点を当ててきました。 DRN への STN 投射ニューロンが欠如しているため、5-HT 神経伝達の阻害は多重シナプス ニューロン ネットワークによって媒介されると仮定されています。 側手綱核は、DRN への明確に定義された主要な抑制入力構造としてこのネットワークに寄与している可能性があり、5-HT フィードバック機構において重要な役割を果たしていると考えられています 21,22。 STN は DRN から 5-HT 入力を受信しますが、これらの入力を介した 5-HT セルに対する STN-DBS の直接的な影響に関する証拠はありません。 電気生理学的研究により、DRN12 から記録された刺激周囲時間ヒストグラムにおいて、STN-DBS が逆行性応答や短潜時 (< 10 ms) 正行性応答を誘導しないことが実証されました。 また、STN-DBS が、外側手綱核を含むさまざまな前脳領域から主要な入力を受ける DRN の外側翼での c-Fos 発現によりニューロン活動を増加させることも発見しました 21。 ただし、5-HT 受容体媒介阻害や DRN 微小回路の変化などの他のメカニズムを完全に排除することはできず、我々の観察に寄与する可能性があります。 急性 STN-DBS は、DRN22 に投射する手綱ニューロンのニューロン発火速度を変化させることが示されています。 STN-DBS が 5-HT の神経伝達と恒常性にどのような影響を与えるかはまだ不明です。 しかし、一部の細胞は継続的な刺激の存在下で活動電位の内因性スパイクを発火させる能力を取り戻す24が、他のニューロンは刺激の停止後も抑制されたままであることが示されている22。 これらの変化した活動は、おそらく厳格な 5-HT フィードバック メカニズムに影響を与え、ネットワーク内の神経可塑性を引き起こす可能性があります。

私たちの以前の研究は、視床前核の DBS が腹側被蓋野のドーパミン作動性ニューロンの数を増加させることを示しました 25。 これは、DBS による神経伝達物質の再特定を示している可能性があります。 現在の研究では、DRN の eYFP 陽性ニューロンは通常、大部分 (> 90%) で TPH2 を発現するはずです 19。 興味深いことに、STN-DBS が立体学的方法で定量された二重標識 eYFP/TPH2 陽性ニューロンの数を減少させることがわかりました (図 2F–H)。 ePET-Cre は遺伝的に DRN 5-HT ニューロンを特異的に標的としますが、これが全 5-HT 集団の一部であることに留意する必要があります 19。 さらに、この研究では、注入部位の周囲の 5-HT 細胞のみがトランスフェクトされました。 DRN 内の eYFP および TPH2 発現細胞の立体学的定量化では、グループ間に有意差がないことが明らかになりました (図 S4)。 さらに、DRN における c-Fos 発現は STN-DBS によって変化せず、断続的な刺激後の全体的なニューロン活動が安定したままであることを示唆しています (図 S3)。

活性依存性の細胞内カルシウム過渡現象は、細胞の神経伝達物質の表現型を定義する際に重要な転写因子のリン酸化を制御することにより、神経伝達物質の再特定において重要な役割を果たしています17、26、27。 しかし、カルシウム過渡現象が神経伝達物質の再特定をどのように変化させるかは、伝達物質の系や種によって異なるようです。 例えば、成体ラットの視床下部の室傍核におけるドーパミン作動性ニューロンの活性上昇は、長時間の光周期曝露後のドーパミン発現の喪失に必要であることが示された 18 。 一方、アフリカツメガエルを暗闇にさらすことによるカルシウムスパイクの減少は、視床下部におけるドーパミン発現の喪失につながります28。 一見、変化したカルシウム過渡現象は、セロトニン作動性ニューロンに逆の効果を引き起こす可能性があります。 アフリカツメガエルの後脳の活動が抑制されると、縫線核で TPH を発現するニューロンの数が増加しました。 一方、活動の強化は逆の結果をもたらしました27。 私たちの研究では、TPH2 を発現するニューロンの数の減少は、Ca2+ トランジェントの減少と関連していました。 これは、Ca2+活性の増加がドーパミン作動性細胞の表現型の喪失と相関するラットにおけるドーパミン作動性細胞の再特異化とは対照的である18。 5-HT 細胞が GCaMP6s ウイルスでトランスフェクトされた程度は、この研究では定量化されていないことに注意してください。 したがって、すべてのセロトニン作動性細胞で Ca2+ トランジェントが測定されたわけではない可能性があります。

初期の理論では、臨床実践で一般的に使用される刺激設定での DBS は、神経細胞集団の自発発火を減少させ、DBS のリアルタイムおよび局所効果に基づいた「発火率モデル」としても知られる電極付近の軸索投射を駆動することが示唆されていました14。 現在では、ニューロン活動の変化自体は持続不可能な状態であり、ニューロンは時間の経過とともに本来の活動を取り戻し 24、刺激がオフになっている場合でも電気刺激により可塑性関連効果が持続することが十分な証拠によって示されています 29。 同様に、Ca2+ 活性の一時的な変化は伝達物質の再特定を引き起こす可能性があり、これは刺激の時間を超えるネットワークと生化学的効果をもたらす可能性があります。 これらの行動データ、測光データ、および免疫組織化学データを総合すると、5-HT 細胞表現型の刺激由来の喪失に対する重要な役割が正確に示されます。 私たちは、この 5-HT 表現型の喪失が STN-DBS 後の望ましくない抑うつ症状において重要な役割を果たしていると主張します。 5-HT 表現型の消失は、STN-DBS が治療抵抗性の遅発性ジスキネジアを軽減するメカニズムである可能性もあります。 5-HT システムはジスキネジアの症状に関与していると考えられています。 大脳基底核の広範な 5-HT 神経支配はドーパミン神経伝達を調節します 30,31。 ジスキネジーの発生率の低下は、5-HT2 受容体拮抗作用と関連しています 32,33。 さらに、ジスキネジーの症状は、選択的セロトニン再取り込み阻害剤による併用治療によって悪化する可能性があります 34,35,36。 STN-DBS が 5-HT 細胞表現型を抑制するという我々の観察に基づいて、大脳基底核 5-HT 機能の低下がジスキネジーにおける DBS 治療メカニズムの重要な要素であると結論付けることができます。

結論として、神経可塑性の影響を理解することは、DBS によるネットワーク変調と症状の軽減や副作用を理解するために重要です。 この研究は、STN-DBSが中脳縫線核5-HT系におけるカルシウムシグナル伝達の変化を誘導し、結果として神経伝達物質の再特異化を引き起こし、これがPDにおける精神医学的副作用に関与している可能性があるという証拠を明らかにした。 5-HT 細胞の表現型の喪失は、STN-DBS が治療抵抗性の遅発性ジスキネジアを軽減するメカニズムである可能性もあります。

実験は、56 匹の雄トランスジェニック ePET-Cre マウス (JAX ストック; #012,712) で行われました。 動物は、一定の温度、湿度、そして明暗サイクルを逆転させた状態（各 12 時間）で、餌と水を自由に摂取できる状態で社会的に飼育されました。 すべての動物手順は、「動物研究：生体内実験の報告（ARRIVE）」ガイドラインに従って実行されました。 動物手順は、動物科学的手順中央局 (CCD; プロトコール # AVD107002016543) に従って、マーストリヒト大学の施設内動物管理委員会によって審査され、承認されました。

マウスは、次の 4 つのグループの 1 つにランダムに割り当てられました: NaCl-sham、NaCl-STN-DBS、MPTP-sham、または MPTP-STN-DBS。 定位手術の２週間前に、マウスにＭＰＴＰ（３０ｍｇ／Ｋｇ ｉ．ｐ．）またはＮａＣｌ（０．９％ ｉ．ｐ．）を５日間連続して注射した。 定位手術 37 は、鎮痛剤前治療 (ブプレノルフィン、0.1 mg/Kg sc) の後、イソフルラン吸入麻酔 (Abbott Laboratories; 導入 4%、維持 1.5 ～ 2%) の下で実施されました。 マウスの頭部を定位固定フレーム (Stoelting) に配置し、固定しました。 体温調節パッドを使用して体温を 37 °C に維持しました。 局所麻酔（リドカイン 1% sc）後、頭蓋骨を露出させ、両側 STN 電極を移植するためのバリ穴を作成しました（マウス脳アトラスに基づくブレグマからの座標：AP − 2.00 mm、ML ± 1.50 mm、DV − 4.55 mm 38）。 ）およびファイバー測光プローブ（400μm; 0.48NAパッチコード）をDRNに埋め込みました（マウス脳アトラスに基づくブレグマからの座標：AP - 4.5、ML - 0.25、左から32°の角度でDV-2.9）。

同じ手術中、移植が行われる前に、2 つのウイルス ベクターが DRN に注入されました。 eYFPをコードするCre依存性アデノ随伴ウイルス（AAV5.EF1a.DIO.eYFP.WPRE.hGH; Penn Vector Core、米国）をDRNに注入しました（1.0μl、0.1μl/分の速度で）。 さらに、蛍光 Ca2+ インジケーター GCaMP6s の標的遺伝子コード化を保証する AAV ベクター (AAV5.Syn.Flex.GCaMP6s.WPRE.SV40; Addgene, USA) も同じ座標に注入しました (500 nL; Nanoject I; Drummond Scientific ）。

2 週間の回復後、130 Hz、パルス幅 60 μs、電流強度 80 μA の単相高周波刺激による 20 分間の刺激セッション (週 5 回) で STN-DBS を 10 週間実施しました。 偽刺激された動物は接続されましたが、刺激は省略されました。 DBS 構造は、それぞれ電極間距離が 3.0 mm、長さが 5.5 mm の 2 つの双極金被覆同心電極から構成されていました。 外側のステンレス鋼部品と内側の白金イリジウム部品は、それぞれプラス極とマイナス極として機能します。 同心針の外径は 300 μm（絶縁体を含む）、電極表面積は 0.021 mm2、陽極と陰極間の距離は 50 μm37 である。 電極の表面積は 0.021 mm2 であるため、選択したパラメーターの電荷密度は 22.9 μC/cm2 となり、神経損傷のシャノン モデルに基づく限界である 30 μC/cm2 を大幅に下回っています 39。

DRN ニューロンの Ca2+ 過渡現象は、確立されたファイバー測光技術を使用して、MPTP マウスと生理食塩水で処理したマウスで測定されました 37。 この方法により、STN-DBS 中の GCaMP6 のバルク Ca2+ 依存蛍光の測定が可能になりました。 カルシウム信号の記録には、2 波長 GCaMP ファイバー測光システム (Doric Lenses Inc.、ケベック、カナダ) を利用しました。 ＧＣａＭＰおよびＣａ２＋に依存しない蛍光シグナルは、それぞれ４７０ｎｍのＬＥＤおよび４０５ｎｍのＬＥＤ（等吸収基準シグナル）によって交互に励起された。 GCaMP6 の蛍光発光は Newport 2151 フェムトワット光受信機モジュールで捕捉され、信号は Doric Neuroscience Studio ソフトウェアと統合されたフィールド プログラマブル ゲート アレイ (FPGA) ベースのデータ収集ユニットに中継されました。 測光実験中、マウスはホームケージ内を自由に移動できました。 STN-DBS を断続的に (オン 2 分 - オフ 3 分) 10 回の試行 (試行あたり 5 分) 適用し、その間、DBS オン/オフ段階で測光測定を実行しました。 カスタム MATLAB (Mathworks) スクリプトを使用してカルシウム過渡現象を抽出、処理、分析しました。 蛍光シグナルの最初の急速な退色を除去するために、馴化期間中のデータの最初の 2.5 分間は破棄されました。 次に、元のサンプリング レート 100 Hz が 1 Hz にダウンサンプリングされ、ローパス フィルターがかけられました。 2 項指数関数モデルをフィッティングし、デシメートされたデータから差し引いて、遅い漂白アーチファクトを考慮しました。 次に、DBS 前の 60 秒間の蛍光シグナルを平均することによって、単一のベースライン蛍光値 (F0) を計算しました。 続いて、正規化された蛍光変化 (dF/F) を F − F0/F0 として計算しました。 データは、SEM による平均プロットとして表示されます。 順列検定を使用して、DBS 関連の蛍光変化の統計的有意性を分析しました 40。 各時点での dF/F の値を DBS 関連の蛍光変化と比較するために、10,000 個の順列を使用しました。 α レベル ≤ 0.05 は有意であるとみなされます。

MPTP および STN-DBS 関連の運動効果は、コンピューター化された歩行分析セットアップ (CatWalkXT; Noldus) によって評価されました。 マウスは硬いガラスで覆われた床のある囲まれた廊下を走り回った。 足跡は高速カメラで記録され、そこから平均速度、ステップサイクル、ターミナルデュアルスタンス、スタンスなどの歩行関連の動作パラメーターが分析されました。 各マウスの 5 回連続の中断のない直線走行を統計分析に使用しました 41。

強制水泳テスト（FST）は、公開されたプロトコルに基づいて絶望行動を評価するために使用されました42。 マウスを、23〜25℃の水（深さ30cm）で満たされた脱出不可能なプラスチック製の円筒形容器（高さ40cm×直径19cm）に入れました。 6 分間の試行中に不動の継続時間が記録されました。 不動とは、動かないか、機首を水面上に保つためにわずかに動いている時間として定義されました。

実験の最後に、マウスをペントバルビタールで深く麻酔し、タイロード緩衝液で経心臓的に灌流した後、0.1 M リン酸緩衝液中の氷冷した4% パラホルムアルデヒド固定液を注入した。 脳を抽出し、4% パラホルムアルデヒドで一晩固定し、20% スクロースに 5 °C で 24 時間浸しました。 脳をクライオスタット上で冠状スライス (厚さ: 22 μm) に切断し、-80 °C で保存しました。 電極先端の位置を評価するために、標準的なヘマトキシリン・エオシン染色を実行しました（図S1A）。 電極が間違って配置されている動物は、行動および組織学的分析から除外されました。

MPTP 誘発ドーパミン枯渇は、チロシン ヒドロキシラーゼ (TH) 免疫組織化学によって評価されました。 SNcを含む切片を、THに対して生じた一次抗体(ウサギポリクローナル抗TH抗体; Santa Cruz Biotechnology Inc; 1:1000)とともに一晩インキュベートした。 翌日、切片を二次抗体（ロバ抗ウサギ alexa 647、Jackson Immunoresearch Laboratories; 1:400）とともに 1 時間インキュベートしました。 その後、切片をマウントし、カバースリップをかけました (Immu-Mount、米国)。 2 つの解剖学的ブレグマ レベル (マウス脳アトラス AP − 2.92 および − 3.16 38 に基づいて調整) の写真を、オリンパス BX50 顕微鏡に接続されたオリンパス DP70 デジタル カメラで撮影しました。 半定量的な TH 細胞計数は、ImageJ ソフトウェア (米国国立衛生研究所) を使用して実行されました。

DRN の全体的なニューロン活動を評価するために、c-Fos の免疫組織化学的発現を評価しました。 DRN 切片を一次抗 c-Fos 抗体 (ウサギ ポリクローナル抗 c-Fos; Abcam; 1:1000) とともに一晩インキュベートしました。 続いて、二次抗体 (ロバ抗ウサギ alexa 594、Jackson immunoresearch Laboratory; 1:200) と 1 時間インキュベートしました。 ブレグマ - 4.16 ～ - 4.96 から 8 枚のスライスを選択し、Olympus Camera DP72 (Olympus、ドイツ) に接続した Olympus BX51 蛍光顕微鏡 (Olympus、ドイツ) で写真を撮影しました。 すべての明確な c-Fos 発現ニューロンをカウントしました (FiJi v2.0.0、国立衛生研究所、メリーランド州)。

STN-DBSが5-HT DRNニューロンを発現するeYFPの5-HT合成に影響を与えるかどうかを評価するために、5-HT合成の律速酵素であるTPH2免疫組織化学のために組織を処理した。 DRN 切片を一次抗 TPH2 抗体 (ヤギ ポリクローナル抗 TPH2; Abcam; 1:2000) とともに一晩インキュベートしました。 続いて、二次抗体 (ロバ抗ヤギ alexa 647、Jackson Immunoresearch Laboratories; 1:200) と 2 時間インキュベートしました。 デジタル顕微鏡に接続された蛍光スピニングディスク共焦点顕微鏡（DSU、オリンパス BX51、日本）を使用して、マウスあたり 7 つの DRN セクションで二重標識 eYFP/TPH2 ニューロンの立体学的分析を実行しました（Stereo Investigator、Microbrightfield Bioscience、Williston、VT、USA）。超高感度 CCD カメラ (C9100-02、浜松ホトニクス、日本)。 光学的分別プローブを使用して立体学的細胞計数を実行し、検証された立体学的方法を使用して二重標識細胞の総数を推定しました 43,44。

統計分析は、SPSS 26.0 ソフトウェア (SPSS Inc.、シカゴ、米国) を使用して実行されました。 行動および免疫組織化学的データは、二元配置分散分析を使用して分析されました。 ボンフェローニ事後ペアワイズ比較は、グローバル ANOVA テストの結果が有意である場合に (その場合に限り) 実行されました。 2 つのグループのデータを比較するために、独立した T 検定を使用しました。 データは平均値および平均値の標準誤差 (± SEM) として表示されます。 すべてのデータは正規分布しており、統計的有意性は p 値 < 0.05 によって定義されました。 測光データはカスタム Matlab (MathWorks) スクリプトを使用して処理および分析されました。 カルシウムの過渡状態を統計的に評価するために順列テストが実行されました40。

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この研究は、オランダ科学研究機構 (助成金番号: 91616043 (NWO-VENI)) によって AJ に資金提供されました。 FAはキング・アブドゥルアズィズ大学の博士課程奨学金に感謝します。 著者らは、Mさんに感謝しています。 ポル氏は、生体内実験への貢献に感謝します。

マーストリヒト大学医療センター脳神経外科、P. Debyelaan 25、6202AZ、マーストリヒト、オランダ

ファイサル・アロサイミ、ヤシン・テメル、サラ・ヘシャム、ファリス・アルマサビ、ソニー・K・H・タン、アリ・ジャハンシャヒ

アーヘン工科大学病院神経科、アーヘン、ドイツ

ヴィクトリア・S・ファニー

アーヘン大学病院脳神経外科、アーヘン、ドイツ

ソニー・K・H・タン

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AJ が研究をデザインし、AJ が in vivo 研究を実施し、FA、VW、および FA (F. Almasabi) が免疫組織化学および顕微鏡研究を実施、AJ が in vivo 研究のプログラムを設計および適応させ、生データの管理をサポートしました。 FA はデータを分析して原稿を執筆し、SH、ST、YT はデータの解釈、原稿の執筆と編集に貢献しました。 著者全員が原稿の最終版を読んで承認しました。

アリ・ジャハンシャヒへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

アロサイミ、F.、テメル、Y.、ヘシャム、S. 他。 視床下核の高周波刺激は、細胞表現型の喪失を介してセロトニン作動系の持続的な阻害を誘導します。 Sci Rep 12、14011 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-18294-6

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受信日: 2022 年 1 月 4 日

受理日: 2022 年 8 月 9 日

公開日: 2022 年 8 月 17 日

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